目的  对乌毛蕨科狗脊属植物狗脊蕨Woodwardia japonica（L.f.）Smith和单芽狗脊蕨Woodwardia unigemmata（Makino）Nakai的药材进行区分和评价，为狗脊贯众药材的质量控制提供依据。

方法  采集不同产地的狗脊蕨贯众和单芽狗脊蕨贯众药材，建立定性定量测定方法对两种基源药材进行鉴别研究和质量比较。

结果  归纳整理了狗脊蕨贯众和单芽蕨狗脊贯众药材在性状、显微特征方面的差异，建立了专属性较强的TLC鉴别、HPLC鉴别和含量测定方法。二者性状及显微特征相似，但狗脊蕨叶柄残基横切面分体中柱2~4个，而单芽狗脊蕨为5~8个；狗脊蕨TLC色谱斑点和HPLC色谱峰均少于单芽狗脊蕨；狗脊蕨和单芽狗脊蕨中原儿茶醛与原儿茶酸的含量无明显差异。

结论  本研究可有效区分狗脊蕨贯众和单芽狗脊蕨贯众药材，为其质量评价和控制提供参考依据。

狗脊贯众是我国应用已久的中药材，来源于乌毛蕨科狗脊属植物，具有一定的抗菌抗病毒、促凝血、子宫抑制和杀虫等作用[1]，临床上用于治疗风热感冒、痈疮肿毒、虫积腹痛、吐血、便血、血崩及外伤出血[2]。我国狗脊属植物有5种，主要分布于长江中下游以南各省及陕西、甘肃、西藏等地，生于疏林下潮湿处及山谷灌丛中，文献记载狗脊属植物主要含有黄酮类、三萜类、甾醇类和酚酸类等成分[3-5]。湖北、上海、山西、河南等地的中药材标准收载了狗脊蕨Woodwardia japonica（L.f.）Smith和单芽狗脊蕨Woodwardia unigemmata（Makino）Nakai 2种作为狗脊贯众的药材来源，质量标准大多仅包含性状和显微鉴别，个别标准有TLC鉴别，但专属性不强，无法有效区分和评价质量的优劣。本研究从性状、显微鉴别、TLC鉴别、HPLC鉴别、含量测定等方面区分和评价两种基源狗脊贯众药材的质量[6-10]，为正确利用该药材资源提供参考。

1 材料

1.1 主要仪器

SZX7体式显微镜（日本奥林巴斯）；DM2500偏光显微镜（德国莱卡）；X205BDU电子天平（瑞士梅特勒-托利多）；TLCSCANNER3型薄层照相仪（美国卡玛）；Agilent1260高效液相色谱仪（美国安捷伦）；CLXXXUVM2超纯水机（英国希尔科）。

1.2 主要药品与试剂

对照品：原儿茶醛（批号：110810-201909，纯度99.6%、原儿茶酸（批号：110809-202207，纯度97.5%）、山柰苷对照品（批号：1111775-200701）均购自中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱纯，其他试剂为分析纯；11批狗脊贯众药材（单芽狗脊蕨贯众5批、狗脊蕨贯众6批），采集自湖北恩施、宜昌和贵州贵阳等地，均经湖北中医药大学陈科力教授作基源鉴定，具体见表1。

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  表格1 样品信息

  Table 1.Sample information

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2 方法与结果

2.1 性状

狗脊蕨贯众：呈长圆柱形，挺直或稍弯曲，长6~26 cm，直径2~7 cm，表面红棕色或黑褐色。根茎粗壮，密被粗短的叶柄残基，近顶端鳞片较多，棕红色。叶柄残基近半圆柱形，镰刀状弯曲，背面呈肋骨状，下端膨大；横断面可见分体中柱2~4个，腹面的1对较大，成八字形或略弯曲成双曲形排列。质坚硬。气微，味微苦、涩。具体见图1。

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  图1 狗脊蕨贯众和单芽狗脊蕨贯众药材性状图

  Figure 1.Characteristic diagram of medicinal herbs of Woodwardia japonica (L.f.) Smith and Woodwardia unigemmata (Makino) Nakai

  注：A、B. 狗脊蕨；C、D. 单芽狗脊蕨。

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单芽狗脊蕨贯众：呈长圆柱形或削成柱状、方柱状，挺直或稍弯曲，上端较粗钝，下端较尖，长6~30 cm，直径2~7 cm。表面红棕色或黑褐色。根茎粗壮，密被粗短的叶柄残基、鳞叶，可见须根。叶柄残基坚硬，横断面半圆形，深棕色或棕黄色，有黄棕色分体中柱5~8个，其中腹面1对较大，呈八字形排列。鳞叶棕红色，全缘。须根棕黑色。气微，味微苦、涩。具体见图1。

性状主要鉴别点：叶柄残基横断面分体中柱的个数，具体见图2。

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  图2 狗脊蕨贯众和单芽狗脊蕨贯众叶柄残基横切面图

  Figure 2.Cross sectional view of petiole residue of Woodwardia japonica (L.f.) Smith and Woodwardia unigemmata (Makino) Nakai

  注：A. 狗脊蕨；B. 单芽狗脊蕨。

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2.2 显微鉴别

狗脊蕨叶柄残基横切面：表皮细胞1列，其内侧为数列厚壁细胞，基本薄壁组织中，有的细胞壁具微孔，有的含有棕色物质；分体中柱外侧的薄壁细胞含棕色物质。分体中柱2~4个，位于腹面1对较大，呈“八”字状排列，维管束外韧型，除韧皮部外，其余细胞壁均木化；木质部略呈“ε”形。具体见图3。

单芽狗脊蕨叶柄残基横切面：与狗脊蕨叶柄残基横切面显微特征基本相同，棕色分泌物较多，除腹面1对较大中柱外，其他分体中柱均为类圆形。具体见图3。

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  图3 叶柄残基横切面图

  Figure 3.Cross sectional view of petiole residue

  注：A. 狗脊蕨叶柄残基横切面局部放大图（100×）；B. 狗脊蕨皮层；C. 狗脊蕨分体中柱；D. 单芽狗脊蕨叶柄残基横切面局部放大图（100×）；E. 单芽狗脊蕨皮层；F. 单芽狗脊蕨分体中柱；1. 表皮细胞；2. 厚壁细胞；3. 薄壁组织；4. 分体中柱；5. 薄壁细胞（含棕色物质）；6. 韧皮部；7. 木质部。

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2.3 TLC鉴别

2.3.1 黄酮类

称取样品粉末1 g，加入甲醇25 mL，超声提取（功率：250 W，频率：50 kHz）30 min，过滤，取滤液作为供试品溶液。另取狗脊蕨贯众或单芽狗脊蕨贯众对照药材1 g，同法制备，作为对照药材溶液。照TLC法试验[11]，吸取供试品和对照药材溶液各1~2 μL，分别点在同一聚酰胺薄膜上，使成条带状，采用30%冰醋酸溶液进行展开，取出，晾干，喷以5%三氯化铝乙醇溶液，用热风吹干，置紫外光灯（365 nm）下检视。TLC色谱图中，狗脊蕨贯众荧光斑点个数明显少于单芽狗脊蕨贯众。具体见图4。

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  图4 黄酮类TLC色谱图

  Figure 4.TLC chromatogram of flavonoids

  注：1. 狗脊蕨贯众对照药材（GJ-1）；2. GJ-2；3. GJ-3；4. GJ-4；5. GJ-5；6. GJ-6；7. DYGJ-1；8. 单芽狗脊蕨贯众对照药材（DYGJ-1）；9.  DYGJ-2；10. DYGJ-3；11. DYGJ-4；12. DYGJ-5；13. GJ-1；14. GJ-2。

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2.3.2 儿茶酸类

称取样品粉末2 g，用80%甲醇50 mL回流提取1 h，放冷，过滤，滤液置80℃水浴蒸干，残渣用20 mL水溶解，加乙醚萃取2次，每次20  mL，合并乙醚液，挥干，残渣加入0.5  mL甲醇溶解，作为供试品溶液。另取狗脊蕨贯众或单芽狗脊蕨贯众对照药材2 g，同法制备，为对照药材溶液。再取原儿茶醛、原儿茶酸对照品，加入甲醇制成每1 mL各含1 mg的溶液，为对照品溶液。照TLC法试验[11]，吸取供试品、对照药材、对照品溶液各10 μL，分别点在同一硅胶GF254薄层板上，采用氯仿-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（12 ∶  2 ∶  1 ∶  0.3）进行展开，取出，晾干，置紫外光灯（254 nm）下检视，然后喷以5%三氯化铁乙醇溶液，105℃加热5 min，日光下检视。在TLC色谱图中，狗脊蕨贯众和单芽狗脊蕨贯众药材的斑点个数与大小存在一定差异。具体见图5。

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  图5 儿茶酸类薄层色谱图

  Figure 5.TLC chromatogram of catechins

  注：1. 狗脊蕨贯众对照药材（GJ-1）；2. GJ-2；3. GJ-3；4. GJ-4；5. GJ-5；6. GJ-6；7. 原儿茶醛对照品；8. 原儿茶酸对照品；9. 单芽狗脊蕨贯众对照药材（DYGJ-1）；10. DYGJ-2；11. DYGJ-3；12. DYGJ-4；13. DYGJ-5。

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2.4 HPLC鉴别

称取样品粉末2 g，置锥形瓶中，加入水40  mL，加热回流1 h，静置，取上清液至分液漏斗中，用乙酸乙酯萃取2次，每次30 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加70%甲醇10  mL溶解，滤过，滤液作为供试品溶液。取原儿茶酸、原儿茶醛、山柰苷对照品适量，加入甲醇制成每1 mL含原儿茶酸0.02 mg、原儿茶醛0.02  mg、山柰苷0.10 mg的溶液，作为对照品溶液。另取狗脊蕨贯众（GJ-1）或单芽狗脊蕨贯众（DYGJ-1）对照药材2 g，同供试品溶液制备，作为对照药材溶液。采用HPLC法，色谱柱为GL Science ODS-3 C₁₈柱，以乙腈（A）-1%冰醋酸溶液（B）进行梯度洗脱（0~30 min，20%→40% A；30~40  min，40%→80% A），流速为1.0  mL/ min，柱温为30℃，检测波长为260 nm。吸取供试品、对照品、对照药材溶液各10 µL，分别注入HPLC色谱仪进行测定，记录色谱图。单芽狗脊蕨贯众的色谱峰个数明显多于狗脊蕨贯众；二者均可检出原儿茶醛、原儿茶酸色谱峰；但前者可明显检出的山柰苷色谱峰，在后者色谱图中却未检出。具体见图6。

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  图6 HPLC鉴别色谱图

  Figure 6.HPLC identification chromatograms

  注：A. 对照品；B. 单芽狗脊蕨供试品；C. 狗脊蕨供试品；1. 原儿茶酸；2. 原儿茶醛；3. 山柰苷。

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2.5 含量比较

2.5.1 HPLC色谱条件

采用GL Sciences ODS-3色谱柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm），以乙腈（A）-1%冰醋酸溶液（B）进行梯度洗脱（0~30 min，3%→12% A），流速为1.0 mL/min，柱温为30℃，检测波长为260 nm，进样体积为10 μL[12]。

2.5.2 溶液的制备

对照品溶液：取原儿茶酸对照品23.10 mg、原儿茶醛对照品15.55 mg，精密称定，置同一50  mL量瓶中，加少量甲醇使溶解，用70%甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液；精密吸取对照品储备溶液1.0 mL，置25 mL量瓶中，用70%甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液（含原儿茶酸18 μg/mL，原儿茶醛12 μg/mL）。

供试品溶液：取样品粉末（过三号筛）约2 g，精密称定，置锥形瓶中，加水40 mL，加热回流1  h，放冷，1 604×g离心5 min，上清液转移至分液漏斗中，用乙酸乙酯萃取4次，每次30 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣用70%甲醇使溶解，转移至10 mL量瓶中，加70%甲醇定容至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得。对照品溶液和供试品溶液的HPLC色谱图见图7。

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  图7 含量测定HPLC色谱图

  Figure 7.HPLC chromatograms for content determination

  注：A. 混合对照品；B. 单芽狗脊蕨供试品；C. 狗脊蕨供试品；1. 原儿茶酸；2. 原儿茶醛。

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2.5.3 线性考察

精密吸取对照品储备溶液4、2、1、4、2、1、0.4 mL，分别置10、10、10、100、100、100、100 mL量瓶中，用70%甲醇稀释至刻度，摇匀，制成含原儿茶酸1.801 8~180.18 μg/mL和原儿茶醛1.239 0~123.90 μg/mL的线性溶液，按“2.5.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，以浓度为横坐标（X，μg/mL）、峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，原儿茶酸和原儿茶醛的线性方程分别为：Y=34.356X-5.429 5（r=1.000 0）、Y=19.515X-6.472 4（r=0.999 9），表明原儿茶酸和原儿茶醛在上述浓度范围内线性良好。

2.5.4 精密度试验

精密吸取对照品溶液，按“2.5.1”项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图。结果原儿茶酸和原儿茶醛峰面积的RSD分别为0.12%和0.25%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.5.5 稳定性试验

取DYGJ-5样品，按“2.5.2”项下方法制备供试品溶液，分别放置0，4，8，12，18，24 h后按“2.5.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果原儿茶酸和原儿茶醛峰面积的RSD分别为0.53%和1.33%（n=6），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.5.6 重复性试验

取DYGJ-5样品6份，每份2 g，按“2.5.2”项下方法平行制备供试品溶液，再按“2.5.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。采用外标法计算得样品中原儿茶酸和原儿茶醛的平均含量分别为0.012 4%、0.007 8%（按干燥品计算），相应的RSD分别为1.18%和1.84%（n=6），表明方法重复性良好。

2.5.7 加样回收试验

取DYGJ-5样品6份，每份1 g，分别精密加入对照品储备溶液（原儿茶酸180.18 μg/mL、原儿茶醛123.90 μg/mL）0.6 mL，按“2.5.2”项下方法平行制备供试品溶液，再按“2.5.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。采用外标法计算原儿茶酸和原儿茶醛的含量，并计算得其平均回收率分别为97.82%、94.90%，RSD分别为1.75%和3.86%（n=6），表明方法准确度良好。

2.5.8 样品测定

取收集到的11批狗脊贯众药材样品，分别按“2.5.2”项下方法平行制备供试品溶液，再按“2.5.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，采用外标法计算原儿茶酸和原儿茶醛的含量，结果见表2。由测定结果可知，狗脊蕨贯众和单芽狗脊蕨贯众中原儿茶酸和原儿茶醛的含量均较低，且二者含量无明显差异。

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  表格2 含量测定结果（n=2）

  Table 2.Content determination results (n=2)

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3 讨论

贯众为我国常用中药，但历来品种混乱，有文献[13]将狗脊蕨和单芽狗脊蕨记载为中药“贯众”的来源之一，但近年来大多资料将其以“狗脊贯众”之名与主流商品贯众（药典收录品种）分开单列[2]。调查发现我国湖北、湖南、陕西、河南、甘肃等地区仍将狗脊蕨贯众和单芽狗脊蕨贯众作为商品贯众进行流通使用[14]。

狗脊蕨贯众和单芽狗脊蕨贯众属同一科属，性状和显微特征相似，但所含的化学成分有明显不同[15]。本研究显示狗脊蕨和单芽狗脊蕨均含有原儿茶酸等酚酸类成分，但单芽狗脊蕨贯众富含的山柰苷及其衍生物类黄酮化合物，在狗脊蕨贯众中几乎无或含量较低。山柰苷类黄酮具有广泛的药理活性[16-17]，并且是狗脊贯众抗菌消炎作用的主要物质基础。二者黄酮含量不同，从而导致两者的用药剂量与药效之间可能存在差异。若临床用药剂量相同，必然会导致疗效的不同。待后期收集更多样品，对不同基源的狗脊贯众药材进行深入系统的化学成分分析及药理活性研究，进一步规范狗脊贯众药材的分类及用量与用途的关系，从而更好地开发利用这一重要的药用植物资源。

本研究从化学成分种类入手，建立了专属性较强的黄酮类物质和酚酸类物质的TLC鉴别方法，含量测定则选择了狗脊蕨贯众和单芽狗脊蕨贯众共同含有的原儿茶酸和原儿茶醛作为指标，供试品提取方法考察了超声提取和回流提取，结果回流提取效率高于超声提取，同时考察了水、1%冰醋酸、30%甲醇、70%甲醇、甲醇等几种提取溶剂，30、45、60、120 min等提取时间，最后确定采用水回流提取1 h。样品提取后直接进样，目标峰与杂质峰无法完全分离，且峰面积较小，最后采用乙酸乙酯萃取进行纯化，萃取4次后转移率能达到95%以上。

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