目的  评价白脉软膏中不同抑菌剂的抑菌效力，筛选最佳处方。

方法  依据《中国药典（2020年版）》四部通则1121抑菌效力检查法，选用5种阳性菌作为指示菌，对4个不同处方的白脉软膏样品进行抑菌效力检测。

结果  样品2在7 d时对金黄色葡萄球菌的抑菌效果不达标（lg值仅下降2.9），且在28 d时金黄色葡萄球菌和黑曲霉均出现增殖（lg值增加＞0.5）；样品4在7、14、28 d时铜绿假单胞菌持续增殖，白色念珠菌在28 d时也出现增殖（lg值增加＞0.5）；而样品1和样品3符合药典要求，其中样品1的抑菌效果最优。

结论  在白脉软膏的制剂研发过程中，必须对处方进行系统的抑菌效力评价，并选择适宜种类和剂量的抑菌剂，以确保制剂的安全性。

白脉软膏是一种由姜黄、肉豆蔻、甘松、阳起石、甘草、人工麝香、干姜、藏茴香、藏菖蒲、花椒、碱花等中药组成的藏药复方外用制剂[1]，主要用于缓解肌肉酸痛、关节僵硬、皮肤炎症等与“白脉病”（藏医概念，涉及神经、肌肉及皮肤问题）相关的症状。根据《中国药典（2020年版）》四部通则0109软膏剂的规定，若软膏剂本身抗菌效力不足，需添加适宜的抑菌剂以确保制剂在贮藏和使用过程中免受微生物污染，尤其是多剂量包装的制剂。目前，抑菌效力的评价研究多集中于液体制剂[2]，而按照《中国药典（2020年版）》四部通则1121抑菌效力检查法[3]，需对白脉软膏中抑菌剂的抑菌效力进行考察，以筛选合理的处方并优化抑菌剂的选择。

1 材料

1.1 主要仪器

SW-CJ-2D型超净工作台（苏州苏净仪器自控设备有限公司）；CLASS11BSC型生物安全柜（ESCD）；BPMJ-250F型生化培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；MSL-3781L-PC型压力消毒器（松下）；WT100-2型恒温水浴锅（杭州米欧仪器有限公司）；6C13080177型电冰箱（江苏白雪电器厂）；BX53+DP74型显微镜（奥林巴斯）；101-3AB型电热恒温干燥箱（北京科伟永兴仪器有限公司）；JMA5001型天平（诸暨超泽衡器设备有限公司）。

1.2 主要药品与试剂

白脉软膏由甘肃奇正藏药有限公司提供，规格：20 g/支，处方中所添加的抑菌剂种类及剂量由企业确定，实验室将样品随机编号为样1~样4，批号分别为：2012001（样1）、2012002（样2）、2012003（样3）、2012004（样4）；胰酪大豆胨液体培养基（Trypticase Soy Broth，TSB，批 号：20191114）、胰酪大豆胨琼脂培养基（Tryptose Soya Agar ，TSA，批号：20200229）、沙氏葡萄糖液体培养基（Sabouraud Dextrose Broth，SDB，批号：20180914）、沙氏葡萄糖琼脂培养基（Sabouraud Dextrose Agar，SDA，批号：20191014）、pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液（批号：20200304）均购自青岛海博生物科技有限公司。

1.3 菌种

大肠埃希菌〔CMCC（B）44 102〕、铜绿假单胞菌〔CMCC（B）10 104〕、金黄色葡萄球菌〔CMCC(B) 26 003)〕以及白色念珠菌〔CMCC(F) 98 001〕和黑曲霉〔CMCC(F) 98 003〕均购自中国食品药品检定研究院。

2 方法与结果

2.1 菌悬液制备与菌数测定

取金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌以及黑曲霉的新鲜培养液稀释制成每1 mL含10⁷~10⁸ CFU的菌悬液，其中大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌选用胰酪大豆胨琼脂培养基培养计数，白色念珠菌、黑曲霉选用沙氏葡萄糖琼脂培养基培养计数，测定加入菌量[4]，具体见表1。

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  表格1 试验菌液加入量

  Table 1.Addition amount of experimental bacterial solution

  注：++和+均表示平皿中菌落数大于300 CFU，不可计数。

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2.2 抑菌效力的测定

2.2.1 供试品方法适用性和本底菌数测定

分别取1~4号供试品，制成1 ∶ 10供试液，按照方法适用性试验确定的微生物检查方法进行检测。每个样品稀释2个梯度，每个稀释级平行注入2个无菌平皿（直径90 mm），每皿1 mL，随后加入约20 mL温度不超过45℃的溶化TSB，混匀后凝固，倒置培养。通过平板计数法测定供试品的本底菌数（结果见表2）。在后续抑菌效力检查中，测得的菌数均需扣除供试品本底菌数以消除干扰。

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  表格2 白脉软膏样品1～4的本底菌数测定结果

  Table 2.Measurement results of background bacterial count for samples 1-4 of Baimai ointment

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2.2.2 存活菌数测定

分别取1~4号供试品各30支，制备成10 g/瓶的规格，共30瓶。每瓶分别接种0.1 mL含菌量为10⁶~10⁷ CFU的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、白色念珠菌和黑曲霉菌悬液，混匀后使供试品含菌量为10⁵~10⁶ CFU/g。

 样品于20℃避光条件下贮存，分别在1、2、7、14、28 d取样检测。每次取样时，取含菌样品加入100 mL稀释液制成1 ∶ 10供试液，每种菌液进行3个梯度稀释，每个稀释度进行培养计数，测定每克样品中的活菌数，结果见表3。

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  表格3 白脉软膏接种菌液在不同贮存时间的存活菌数测定结果（CFU/g）

  Table 3.Determination results of the number of surviving bacteria in the inoculation solution of Baimai ointment at different storage times (CFU/g)

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2.3 抑菌效力评价

2.3.1 样品1检测结果

结果显示，金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌和黑曲霉的菌数下降lg值均符合《中国药典（2020年版）》四部通则1121抑菌效力检查法中“A”和“B”级标准。结果表明，1号样品处方中的抑菌剂具有良好抑菌效力，具体数据见表4、图1及表5。

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  表格4 样品1各试验菌株的lg值变化

  Table 4.Changes in lg values of each experimental strain in sample 1

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  图1 样品1各试验菌株lg值的变化趋势图

  Figure 1.Trend chart of lg values of each experimental strain in sample 1

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  表格5 样品1中试验菌株在不同时间点的lg值降低量

  Table 5.Decrease in lg values of the test strains in sample 1 at different time points

  注：NI表示未增加，指对前一个测定时间试验菌增加的数量不超过0.5lg。

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2.3.2 样品2检测结果

结果显示，金黄色葡萄球菌在7 d时的lg值下降量为2.9，但在28 d时金黄色葡萄球菌和黑曲霉的菌数均出现增殖，lg值增加量均超过0.5。根据《中国药典（2020年版）》四部通则1121抑菌效力检查法的规定，2号样品处方中抑菌剂的抑菌效力不符合“A”和“B”级标准要求，具体数据见表6、图2及表7。

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  表格6 样品2各试验菌株的lg值变化

  Table 6.Changes in lg values of each experimental strain in sample 2

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  图2 样品2各试验菌株lg值的变化趋势图

  Figure 2.Trend chart of lg values of each experimental strain in sample 2

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  表格7 样品2中试验菌株在不同时间点的lg值降低量

  Table 7.Decrease in lg values of the test strains in sample 2 at different time points

  注：NI表示未增加，指对前一个测定时间试验菌增加的数量不超过0.5lg。

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2.3.3 样品3检测结果

结果显示，金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌和黑曲霉的菌数下降lg值均达到《中国药典（2020年版）》四部通则1121抑菌效力检查法中“A”和“B”级标准要求，表明3号样品处方中的抑菌剂具有显著抑菌效力，具体数据见表8、图3及表9。

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  表格8 样品3各试验菌株的lg值变化

  Table 8.Changes in lg values of each experimental strain in sample 3

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  图3 样品3各试验菌株lg值的变化趋势图

  Figure 3.Trend chart of lg values of each experimental strain in sample 3

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  表格9 样品3中试验菌株在不同时间点的lg值降低量

  Table 9.Decrease in lg values of the test strains in sample 3 at different time points

  注：NI表示未增加，指对前一个测定时间试验菌增加的数量不超过0.5lg。

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2.3.4 样品4检测结果

结果显示，铜绿假单胞菌在7、14、28 d时均出现菌数增殖，白色念珠菌在28 d时亦呈现增殖现象，两者lg值增加量均超过0.5。根据《中国药典（2020年版）》四部通则1121抑菌效力检查法标准，4号样品处方中的抑菌剂抑菌效力不符合规定要求，具体数据见表10、图4及表11。

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  表格10 样品4各试验菌株的lg值变化

  Table 10.Changes in lg values of each experimental strain in sample 4

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  图4 样品4各试验菌株lg值的变化趋势图

  Figure 4.Trend chart of lg values of each experimental strain in sample 4

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  表格11 样品4中试验菌株在不同时间点的lg值降低量

  Table 11.Decrease in lg values of the test strains in sample 4 at different time points注：NI表示未增加，指对前一个测定时间试验菌增加的数量不超过0.5lg。

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2.3.5 处方的筛选

根据《中国药典（2020年版）》四部通则1121抑菌效力检查法规定，外用制剂抑菌效力标准分为两级：A级标准要求细菌在2 d降低2个lg值、7 d降低3个lg值，真菌在14 d降低2个lg值且28 d菌数未增加；B级标准（适用于可能增加不良反应风险的情况）要求细菌在14 d降低3个lg值，真菌在14 d降低1个lg值且28 d菌数未增加。在1~4号样品检测中，1号和3号样品的抑菌效力检测结果符合上述标准要求。

对符合要求的1号和3号样品在5个时间点（1、2、7、14、28 d）的5种阳性指示菌（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉）存活菌数lg值变化进行分析（图5）。结果表明，1号样品对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的抑制效果明显优于3号样品；而对大肠埃希菌、白色念珠菌和黑曲霉的抑制效果无明显差异（表12）。综合比较显示，两个样品对5种阳性指示菌的抑制效能排序为：1号样品＞3号样品。

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  表格12 5种阳性指示菌菌数的lg值变化

  Table 12.Changes in lg values of 5 positive indicator bacteria

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  图5 5种阳性指示菌菌数lg值的变化趋势图

  Figure 5.Trend of changes in lg values of 5 positive indicator bacteria

  注：A. 金黄色葡萄球菌；B. 大肠埃希菌；C. 铜绿假单胞菌；D. 白色念珠菌；E. 黑曲霉。

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3 讨论

目前，关于抑菌效力的研究主要集中在滴眼液和液体口服制剂[5-6]，而对软膏剂等皮肤外用制剂的抑菌效力研究相对较少[7]。白脉软膏作为皮肤外用制剂，在研发阶段需对其处方进行系统的抑菌效力评价，并添加适宜剂量的抑菌剂，以确保制剂的使用安全性[8-9]。

《中国药典（2020年版）》明确规定，抑菌剂均具有一定毒性，制剂中抑菌剂的添加量应控制在最低有效剂量[10]。多项研究表明，部分抑菌剂存在低毒性风险，过量添加可能对人体健康造成不良影响[11-12]。例如，有文献[13]报道指出，多数萘敏维滴眼液中存在苯扎溴铵过量添加的情况。因此，为确保用药安全， 成品制剂中抑菌剂的有效浓度必须严格控制在安全范围内。

本研究对4个不同处方的白脉软膏样品进行了抑菌效力考察，结果显示：样品2：金黄色葡萄球菌在7 d时的lg值下降量未达到A级标准要求；且在28 d时，金黄色葡萄球菌和黑曲霉均出现增殖（lg值增加量＞0.5），不符合A级和B级标准要求；样品4：铜绿假单胞菌在7 d和14  d的lg值下降量不符合A级和B级标准要求；且在28 d时，铜绿假单胞菌和白色念珠菌均出现增殖（lg值增加量＞0.5）；样品1和样品3：各项指标均符合要求，其中样品1表现出最优异的抑菌效果。基于上述结果，建议制药企业在研发阶段应：建立科学的抑菌体系筛选方案；严格控制抑菌剂添加量，确保其安全有效；加强制剂质量控制，保障人民群众用药安全。

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