目的  探讨延胡索乙素（THP）对高糖诱导HepG2细胞胰岛素抵抗（IR）的潜在治疗机制。

方法  以HepG2细胞构建IR模型，分为对照组（CON）、模型组（HG）和THP干预组（HG+THP）。检测细胞活力、糖摄取能力及磷酸化Akt蛋白水平，评估THP对HepG2细胞胰岛素抵抗的缓解作用。通过检测细胞抗氧化酶[谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）]活性、活性氧（ROS）及脂质过氧化物[丙二醛（MDA）、4-羟壬二酸酯（4-HNE）]含量，评估细胞氧化压力；通过Western blot、qPCR和细胞转染检测THP对核转录因子红系2相关因子2（Nrf2）/抗氧化响应元件（ARE）信号通路相关基因及蛋白表达的影响，验证THP激活Nrf2/ARE途径缓解高糖诱导HepG2细胞胰岛素抵抗的作用机制。

结果  与CON组相比，HG组HepG2细胞2-NBDG摄取量及磷酸化Akt蛋白表达显著降低；此外，HG组细胞内ROS活性增加，GSH-Px、CAT和SOD的酶活力显著下降，MDA和4-HNE含量升高。经THP干预处理后，HepG2细胞氧化应激改善，摄糖能力恢复。Western blot结果显示，THP干预组Nrf2及磷酸化Nrf2蛋白水平增加，下游抗氧化基因NAD(P)H：醌氧化还原酶1（NQO1）、血红素氧合酶1（HO-1）和CAT的转录水平也随之增加。沉默Nrf2能够抑制THP对高糖诱导细胞胰岛素抵抗的治疗作用。

结论  THP通过激活Nrf2/ARE信号通路，增强HepG2细胞抗氧化和摄糖能力，抑制高糖引起的氧化应激和IR，具有开发为治疗IR及代谢性疾病药物的潜力。

胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）是肌肉、肝脏、脂肪等外周组织对胰岛素敏感性降低或反应异常的病理状态[1]，也是肥胖、糖尿病、动脉粥样硬化等代谢疾病的重要风险因素[2]。氧化应激由有害刺激导致，表现为活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成与清除失衡[3-4]。研究表明，高血糖会升高细胞内ROS水平，引发持续氧化应激，与IR相关代谢疾病密切相关[5]。因此，改善氧化应激可能是缓解IR的关键，通过减少ROS生成或增强抗氧化能力，有望干预IR相关代谢疾病。

延胡索乙素（thtrahydropalamatine，THP），又称四氢巴马丁，是中药延胡索的主要活性成分之一，作为多巴胺D2受体阻滞剂，具有镇痛、催眠和抗心律失常等药理作用[6]。近年研究发现，THP在链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠模型中具有降糖效果，可能机制包括抑制促炎因子、增强抗氧化能力以及减少胰岛素细胞凋亡 [7]。程连芝等[8]研究指出，THP通过p38/AMP活化的蛋白质激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）通路抑制小胶质细胞的M1极化，降低糖尿病大鼠体内诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）水平，减轻炎症反应。此外，THP还能通过提升谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性，减轻高糖诱导的H9c2心肌细胞凋亡及氧化应激[9]。THP在抗细胞氧化应激方面具有显著药理作用，但其对高糖诱导的HepG2细胞IR的改善机制尚未明确。本研究旨在探讨THP通过调节核转录因子红系2相关因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）/抗氧化响应元件（antioxidant response element，ARE）通路对高糖诱导的HepG2细胞IR的作用机制，为THP的临床应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要药品与试剂

THP（Aladdin，批号：T101543，纯度＞97%）；胰岛素（美国SigmaAldrich，批号：I5523）；4-羟基壬烯醛（4-hydroxynonenal，4-HNE，批号：H268）、丙二醛（malondialdehyde， MDA，批号：A003）、过氧化氢酶（catalase，CAT，批号：A007）、超 氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD，批号：A001）、GSH-Px（批号：A005）检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；DMEM培养基和胎牛血清购自德国Gibco；青霉素/链霉素（美国HyClone）；2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸 酯（2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA，批号：S0034S）和RIPA 细胞裂解液（批号：P0013C）购自碧云天；siRNA试剂盒（Origene，批号：SR321100）；Stealth RNAi（Origene）；Lipofectamine 2000（美国Invitrogen，批号：11668500）；逆转录试剂盒（Vazyme，批号：R233）；抗体Akt（批 号：ab8805）、磷酸化Akt（批号：ab81283）、Nrf2（批 号：ab62352）、磷酸化Nrf2（批号：ab76026）和内参蛋白GAPDH（批号：ab8245）均购自Abcam；其他试剂均为分析纯。

1.2 细胞培养与模型构建

HepG2细胞于37℃、5% CO₂培养箱，采用低糖DMEM培养基（葡萄糖1.0 g/L）补充10%胎牛血清及1%青霉素/链霉素培养。实验设置3组：正常糖对照组（CON，1.0 g/L葡萄糖）、高糖模型组（HG，4.5 g/L葡萄糖）、THP干预组（HG+THP，高糖培养基+80 μg/mL THP），其中THP以二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解并控制终浓度＜0.1%以排除溶剂毒性。实验过程中高糖处理持续24 h，THP处理持续6 h。随后以50 ng/L胰岛素刺激30 min，通过检测荧光葡萄糖类似物[2-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1, 3-diazol-4-yl)amino)-2-deoxyglucose，2-NBDG]摄取量、培养基上清液葡萄糖含量及Akt磷酸化水平确认模型有效性。

1.3 细胞活力测定

在96孔板中培养HepG2细胞24 h后，用不同浓度的THP（0~320 μg/mL）处理，培养期间更换为无血清培养基。持续不同时间后，每孔加入100 μL的MTT溶液（0.5 mg/mL），置于培养箱中孵育4 h。去除培养基，向每孔加入150 μL的DMSO，使用酶标仪测定570 nm的吸光值。

1.4 糖摄取测定

将HepG2细胞接种于96孔黑透板中，密度为1×104个/孔。细胞达到80%~90%融合后，更换含有100 μmol/L 2-NBDG的无血清MEM进行孵育30分钟。PBS洗涤3次后，使用荧光微板读取器测定荧光强度（Ex/Em：488/520 nm）。对于上清液收集，细胞在80%~90%融合时，进行药物预处理4 h后收集上清液，依据南京建成葡萄糖测定试剂盒说明测量葡萄糖浓度。

1.5 ROS含量测定

使用荧光染料DCFH-DA测定ROS含量。细胞处理后，收集于离心管中，用10  μmol/ L的DCFH-DA染料避光孵育20 min。无血清MEM清洗三次后，PBS重悬细胞，酶标仪测定细胞中ROS的荧光值（激发波长488 nm，发射波长525 nm）。

1.6 细胞转染

使用siRNA试剂盒对HepG2细胞Nrf2敲降，所用siRNA序列为SR321100A-AUUGAUGUUU CUGAUCUAUCACUTT。使用Stealth RNAi作为阴性对照（siCont）。HepG2细胞种于6孔板中，融合率至80%用于细胞转染。饥饿6 h后，利用Lipofectamine 2000将siRNA转染细胞。孵育48  h后，通过Western blotting检测Nrf2蛋白的表达水平。

1.7 qPCR

细胞经PBS冲洗3遍，加入TRIzol试剂提取RNA并测量浓度。采用逆转录试剂盒将mRNA逆转录为cDNA。使用SYBR Green荧光染料进行qPCR分析以确定目的基因表达水平。引物由DynaScience（上海）合成，引物序列见表1。采用2^-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。

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  表格1 引物序列

  Table 1.Primer sequence

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1.8 Western blotting

细胞经PBS冲洗3次后，加入RIPA细胞裂解液，置于冰上裂解30 min，BCA法测定裂解液蛋白含量，经SDS-PAGE电泳，转膜、封闭、孵育一抗（稀释比例1 ∶ 1 000）和二抗（稀释比例1 ∶ 5 000）、曝光显影。检测Akt、磷酸化Akt、Nrf2、磷酸化Nrf2和内参蛋白GAPDH的表达水平。

1.9 统计学分析

使用GraphPad Prism 9软件进行数据统计学分析。实验数据以表示，多组间比较采用单因素方差分析。实验数据取自3次以上独立实验，取平均值。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 THP对HepG2细胞活力的影响

评估不同浓度（0~320 μg/mL）和处理时间（0~48 h）THP对HepG2细胞活力的影响（图1A）。结果显示，THP浓度低于80 μg/mL时，细胞活力与对照组相比无显著变化；而当浓度超过160 μg/mL时，细胞存活率显著降低（P ＜0.05）。以80 μg/mL的THP处理12 h对细胞活力无明显影响，但延长至24 h显著降低活力（图1B，P＜0.05）。故选用80 μg/mL、处理12 h继续后续实验。

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  图1 THP对HepG2细胞活力的剂量与时间依赖性影响（n=3）

  Figure 1.Dose-and time-dependent effects of THP on HepG2 cell viability (n=3)

  注：A. 不同浓度THP处理24 h对细胞活力的影响；B. 不同时间下80 μg/mL THP对细胞活力的影响；aP<0.05。

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2.2 THP缓解高糖诱导的HepG2细胞胰岛素抵抗

用高糖（4.5 g/L）处理HepG2细胞24 h建立胰岛素抵抗模型，并于HG+THP组中添加80  μg/ mL的THP处理6 h。高糖组细胞的2-NBDG摄取量显著下降（P＜0.05），上清液中葡萄糖含量升高；THP干预显著提升2-NBDG摄取（P ＜0.05），降低上清液葡萄糖水平（P＜0.05）。此外，高糖处理显著降低了细胞内p-Akt蛋白水平（P ＜0.05），而THP显著改善此现象，表明其对胰岛素信号通路的抑制具有缓解作用。具体见图2。

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  图2 THP对高糖诱导的HepG2细胞胰岛素抵抗的影响（n=3）

  Figure 2.Effect of THP on high glucose-induced insulin resistance in HepG2 cells (n=3)

  注：A. 胰岛素刺激细胞30 min后2-NBDG荧光量；B. 培养基上清液中葡萄糖含量；C. Akt和p-Akt蛋白条带；D. p-Akt的定量分析；aP<0.05。

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2.3 THP缓解高糖诱导的HepG2细胞氧化应激

与CON组相比，高糖处理显著降低了细胞内GSH-Px活性，且细胞内ROS含量显著升高（P＜0.05）；而THP处理后，显著增强GSH-Px活性并抑制ROS积累（P＜0.05）。同样，与CON组相比，HG组细胞中MDA和4-HNE含量明显增加（P＜0.05）；而经THP处理后，细胞内脂质过氧化物堆积显著减少（P＜0.05），表明其能有效减轻高糖引起的细胞氧化应激。具体见图3。

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  图3 THP对高糖诱导的HepG2细胞氧化应激的影响（n=3）

  Figure 3.Effect of THP on high glucose-induced oxidative stress in HepG2 cells (n=3)

  注：A. GSH-Px活力；B. ROS荧光值；C. MDA含量；D. 4-HNE含量；aP<0.05。

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2.4 THP通过激活Nrf2/ARE信号通路缓解高糖诱导的细胞氧化应激

与HG组相比，HG+THP组中Nrf2和p-Nrf2蛋白水平显著升高（P＜0.05），同时下游靶基因NAD(P)H：醌氧化还原酶1（NAD(P)H：quinone oxidoreductase 1，NQO1）、血红素氧合酶1（Heme Oxygenase-1，HO-1）和Cat的转录水平显著上调（P＜0.05）。此外，THP处理后，HepG2细胞内CAT和SOD酶活力显著增加（P＜0.05），表明THP通过激活Nrf2信号通路缓解高糖诱导的细胞氧化应激。具体见图4。

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  图4 THP对Nrf2/ARE信号通路的调控作用（n=3）

  Figure 4.Regulation of the Nrf2/ARE signaling pathway by THP (n=3)

  注：A. p-Nrf2和Nrf2蛋白条带；B和C. p-Nrf2和Nrf2的定量分析；D. NQO1、HO-1和CAT基因转录水平变化；E.  CAT活力；F. SOD活力；aP<0.05。

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2.5 沉默Nrf2减弱THP改善IR的作用效果

为验证Nrf2/ARE信号的关键作用，通过siRNA敲降Nrf2。敲降后，HepG2细胞内Nrf2和p-Nrf2蛋白表达显著降低（P＜0.05），且THP处理无法恢复高糖诱导的p-Akt蛋白水平，表达减少。同时，敲降Nrf2使THP干预的细胞糖摄取能力远低于对照组（无siRNA处理，P＜0.05），表明THP缓解高糖诱导的细胞IR的作用消失。具体见图5。

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  图5 THP改善胰岛素抵抗依赖Nrf2信号通路

  Figure 5.THP improves insulin resistance via Nrf2 signaling pathway

  注：A. p-Akt、Akt、p-Nrf2和Nrf2蛋白条带；B~D. Nrf2、p-Nrf2和p-Akt的定量分析；E.胰岛素刺激细胞30 min后2-NBDG荧光量；F. 培养基上清液中葡萄糖含量；aP<0.05。

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此外，敲降Nrf2后细胞GSH-Px活性下降，ROS水平显著上升（P＜0.05），且THP干预无法有效清除ROS；敲降Nrf2的细胞内MDA和4-HNE含量维持在较高水平。这些结果表明，THP缓解高糖诱导的氧化应激是由Nrf2/ARE通路介导的。具体见图6。

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  图6 敲降Nrf2时THP无法缓解细胞氧化应激（n=3）

  Figure 6.THP fails to alleviate cellular oxidative stress when knocking down Nrf2 (n=3)

  注：A. GSH-Px活力；B. ROS荧光值；C. MDA含量；D.4-HNE含量；aP<0.05。

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3 讨论

胰岛素抵抗是肥胖症和2型糖尿病的关键病理机制之一，它不仅驱动代谢紊乱，还可能导致慢性炎症和组织损伤[10]。近年来，越来越多的研究揭示氧化应激在胰岛素抵抗的发生和发展中起着核心作用，这种应激状态源于ROS的过量产生与抗氧化防御系统的失衡[11-12]。在生理状态下，胰岛素与其受体结合后，会引发受体自磷酸化，并激活胰岛素受体底物的酪氨酸磷酸化，随后通过PI3K-AKT信号通路传递葡萄糖转运蛋白（glucose transporter，GLUT）的摄糖信号，从而促进细胞内葡萄糖的摄取和利用[13]。然而，氧化应激会导致机体氧化还原平衡严重失调，过量ROS无法被及时清除，这不仅抑制了关键信号通路如蛋白激酶C和C-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal protein kinase，JNK）的调节功能，还通过激活炎症通路如IκB激酶（IκB kinase，IKK）/核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）和细胞内钙信号转导等机制，进一步引发胰岛素信号传导异常，导致胰岛素受体底物功能和GLUT转运受抑制，最终促进胰岛素抵抗的发生[14-15]。

已有研究表明，THP能够通过调控关键信号通路[包括促分裂原活化蛋白质激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、JNK和NF-κB]，有效增强抗氧化能力并改善代谢紊乱。例如，在糖尿病相关模型中，THP被证明能调节PI3K/AKT/GSK-3β信号通路，通过增加葡萄糖转运体GLUT-4的表达和提高抗氧化酶活性，从而缓解肝胰岛素抵抗；同时，THP抑制MAPK（如JNK）和NF-κB的激活，减轻氧化应激和炎症反应[6,  16-17]。然而，目前针对THP在高糖环境下对肝脏胰岛素信号受损的影响尚无相关研究。本研究通过高糖诱导的HepG2细胞胰岛素抵抗模型，发现THP干预能显著改善高糖引起的细胞摄糖能力下降，增加胰岛素信号通路中p-Akt蛋白表达，维持细胞的氧化还原稳态。GSH-Px是广泛存在于体内的重要抗氧化酶，能够将有毒过氧化物转化为无毒产物，保护细胞免受脂质过氧化物（如MDA和4-HNE）的损害[18-19]。研究结果显示，THP能够提高HepG2细胞内GSH-Px活性，显著减少ROS活性及脂质过氧化产物的积累，表明THP可能通过恢复抗氧化系统平衡来减少高糖引发的氧化应激。有研究表明，THP通过增强抗氧化酶活力，降低MDA含量，显著增强了链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠的抗氧化能力并维持机体摄糖能力[8]，这与本研究结果相一致。

Nrf2/ARE是经典的抗氧化信号通路，能够调控多种抗氧化酶和II相解毒酶的表达，从而缓解氧化应激对机体的损害[20]。已有研究表明，Nrf2的激活有助于改善高脂饮食诱导的肝脏代谢紊乱和胰岛素抵抗[21]。研究表明，Nrf2/ARE途径是多种降糖天然产物发挥药效作用的重要靶点。Ding等[22]发现，在高糖诱导的T2DM HepG2细胞中，Ellagic acid（EA）通过miR-223介导的keap1-Nrf2激活改善HepG2细胞氧化应激和胰岛素抵抗。本研究结果表明，THP能增加Nrf2和其磷酸化形式p-Nrf2的表达，同时上调Nqo1、Ho-1和Cat等下游靶基因的表达，显著提高抗氧化酶GSH-Px、SOD和CAT的活性。这些结果表明，THP可通过激活Nrf2/ARE信号通路，减少高糖诱导的ROS和脂质过氧化产物的积累。当使用siRNA沉默Nrf2时，THP缓解高糖诱导的HepG2细胞胰岛素抵抗的效果消失，进一步证明Nrf2/ARE信号通路在THP作用机制中的核心地位。此外，THP的抗氧化效果不仅限于减少ROS的生成，还涉及多靶点、多通路的协同作用。这为开发基于THP的天然抗氧化剂提供了新的思路，有望在治疗胰岛素抵抗、肥胖症、糖尿病等代谢疾病中发挥更大的作用。

综上所述，本研究揭示了THP通过激活Nrf2/ARE信号通路，增强HepG2细胞的抗氧化能力，抑制高糖诱导的氧化应激和胰岛素抵抗的机制，为THP作为代谢性疾病的潜在治疗药物提供了依据和理论基础。未来的研究将聚焦于THP在动物模型中的疗效验证及临床应用前景，以推动其在代谢疾病治疗领域的进一步开发。

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