目的  优选赤芍-牡丹皮药对（1 ∶ 1）水提醇沉工艺。

方法 采用L9（34）正交试验法，以料液比、提取时间、提取次数为考察因素，以芍药苷、丹皮酚的含量及干膏得率为考察指标，采用Hassan法进行多指标综合评分，优选水提工艺；以药液密度、乙醇体积分数、静置时间为考察因素，以芍药苷、丹皮酚的转移率及干膏得率为考察指标，结合大生产实际情况优选醇沉工艺。

结果  最优水提工艺为加10倍量水，煎煮提取1次，每次60 min；最佳醇沉工艺为药液密度1.20 g·mL^-1（30℃），加入95%乙醇使含醇量达60%，静置60 h。

结论  优选的水提醇沉工艺稳定可靠、重复性好，可为赤芍-牡丹皮药对（1 ∶ 1）的后续研究提供参考。

赤芍为毛茛科植物芍药 Paeonia lactiflora Pall.或川赤芍Paeonia veitchii Lynch.的干燥根，牡丹皮为毛茛科植物牡丹Paeonia suffruticosa Andr. 的干燥根皮，两者均具有清热凉血、活血化瘀止痛之功效[1]。两种药材均含有芍药苷和丹皮酚，芍药苷在保护神经细胞、降糖、护肝、调节免疫、抑制肿瘤细胞等方面作用显著[2]，丹皮酚则具有保护神经、降糖、保肝护肾、增强免疫力、抗心律失常、抗菌抗炎等药理活性[3]，卢晨霞等[4]研究表明，赤芍-牡丹皮配伍合煎，可大大提高芍药苷和丹皮酚的溶出率。现代药理学研究表明，两者配伍使用可增大抑菌强度、显著降低血小板聚集率、延长血浆凝血酶时间，还可提高血栓溶解率和全血凝块溶解率[5-7]。此外，赤芍-牡丹皮药对还在临床中用于湿疹、牛皮癣、痤疮等皮肤病的治疗[8-10]。

水提醇沉法是利用药材中的大多数成分如生物碱盐、有机酸类、苷类、氨基酸、多糖等易溶于水和醇中的特性，用水提取，再用不同浓度的醇净化目标化合物的一种方法，是目前中药材中有效成分提取的一种较为常用的方法[11-13]。本研究采用 L₉（3⁴） 正交试验法以芍药苷、丹皮酚的提取量及干膏得率为评价指标，优选赤芍-牡丹皮（1 ∶ 1）药对的水提和醇沉工艺，以期保证两味药材的有效性和均一性，并为以赤芍-牡丹皮配对入药的中药开发研究提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；AS10²00A超声波清洗器（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；XB₁20A型电子分析天平（d=0.1 mg，瑞士普利赛斯公司）；FW100高速万能粉碎机（上海书培实验设备有限公司）。

1.2 试药

赤芍和牡丹皮购自亳州药材大市场，标识产地为安徽，经杭州市第九人民医院李华副主任中药师鉴定，赤芍为毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pall.的干燥根，牡丹皮为毛茛科植物牡丹Paeonia suffruticosa Andr. 的干燥根皮。芍药苷对照品（批号：110736-201943，纯度95.1%）、丹皮酚对照品（批号：110708-201908，纯度99.8%）购自中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱纯（美国天地公司），其余试剂均为分析纯，水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 芍药苷和丹皮酚的含量测定

2.1.1 色谱条件

色谱柱：Shim-pack GISS C₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0~15 min，7%→20%A；15~20 min，20%→30%A；20~35 min，30%→55%A；35~ 50 min，55%→7%A；50~55 min，7%A）；检测波长：245 nm；流速：1.0 mL·min^-1；柱温：35℃；进样量：10 μL[1]。取混合对照品、供试品溶液，按上述条件进样检测，结果杂质峰对芍药苷、丹皮酚色谱峰无干扰，理论塔板数按芍药苷、丹皮酚峰计均大于4 500。HPLC色谱图见图1。

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  图1 赤芍-牡丹皮（1 ∶ 1）药对HPLC色谱图

  Figure 1.HPLC of Radix Paeoniae Rubra-Cortex Moutan drug pair (1 ∶ 1)

  注：1.芍药苷；2.丹皮酚

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2.1.2 混合对照品溶液的制备

取芍药苷和丹皮酚对照品各适量，加甲醇制成每1 mL分别含芍药苷12.250 mg和丹皮酚5.998 mg的混合对照品贮备液；精密量取上液5 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，混匀，0.45 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得混合对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备

水提液：取赤芍、牡丹皮药材，粉碎，过筛（2号筛），取粉末各25.0 g，混合均匀，按正交试验优化条件加水煎煮，滤过，合并滤液，浓缩至约100 mL，加水定容至500 mL，摇匀。精密量取5.0 mL，置于25 mL 量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm滤膜滤过，取续滤液，即得。

水提醇沉液：取水提醇沉上清液，浓缩至约90 mL，加甲醇定容至100 mL，摇匀。精密量取1.0 mL，置于25 mL 量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.1.4 线性关系考察

取“2.1.2”项下混合对照品贮备液，用甲醇稀释成系列浓度待测溶液，注入色谱仪，测定芍药苷和丹皮酚峰面积。以芍药苷、丹皮酚对照品浓度（X，mg·mL^-1）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，进行线性回归，得芍药苷回归方程：Y=1.36×10⁴X+3.99×10²（r=0.999 8），丹皮酚回归方程：Y=2.65×10⁵X-3.80×10（r=0.999 7）。结果表明，芍药苷和丹皮酚分别在为0.245 0~ 4.900 0 mg·mL^-1、0.120 0~2.399 0 mg·mL^-1内呈良好的线性关系。

2.1.5 精密度、重复性、稳定性及加样回收率试验

按相关方法进行试验。结果：精密度试验中，芍药苷和丹皮酚峰面积的RSD分别为0.43％和0.56％（n=6）；重复性试验中，芍药苷和丹皮酚含量的 RSD 分别为0.76％和0.88％（n=6）；稳定性试验中，供试品溶液均在24 h 内稳定，芍药苷和丹皮酚峰面积的 RSD分别为1.11％和1.44％（n=6）；加样回收率试验中，芍药苷和丹皮酚的平均回收率分别为 99.76％和99.10％，RSD分别为0.97％和0.88％（n=6）。上述结果表明，本试验建立的两种成分含量测定方法实用、可行。

2.1.6 样品含量、干浸膏得率测定及总评“归一值”计算

精密吸取正交试验水提液，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件测定，根据线性回归方程，计算样品芍药苷和丹皮酚含量平均值。参照中国药典2020年版四部通则 2201 出膏率测定方法[14]，测定各次实验干浸膏得率。根据Hassan法[15]计算每次试验中芍药苷、丹皮酚含量及干浸膏得率的“归一值”（OD），OD值计算公式：d_i=(Y_i-Y_imin)/(Y_imax-Y_imin)，OD=(d₁d₂d₃)1/2（式中Y_i表示各因变量单次试验测定值，Y_imax和Y_imin系分别指试验中各因变量的最大值和最小值）。

2.2 水提工艺

2.2.1 提取工艺的单因素试验

以水为提取溶剂，取赤芍、牡丹皮药材粉末各25.0 g若干份，在固定另外两个因素的前提下，分别考察因素料液比（4，6，8，10，12倍量水）、提取时间（30，40，60，70，80 min）、提取次数（1，2，3，4次）对综合评价指标OD值的影响。结果，料液比的OD值分别为0.325、0.658、0.986、0.984、0.980，提取时间的OD值分别为0.229、0.790、0.968、0.966、0.960，提取次数的OD值分别为0.957、0.988、0.986、0.976，综合评价指标OD值在加入8倍量水，煎煮60 min，煎煮2次时达到最大值，所以，各考察因素取值为：料液比1 ∶ 8，提取时间60 min，提取次数2次。

2.2.2 提取工艺的正交试验

以提取液中的芍药苷、丹皮酚含量及干浸膏得率的OD值为评价指标，采用L₉（3⁴）正交试验对料液比、提取时间和提取次数3因素进行考察。因素与水平设置见表1，试验设计与结果见表2，方差分析见表3。

由表2直观分析可知，各因素对赤芍-牡丹皮（1 ∶ 1）药对水提工艺的影响为A＞B＞C，各因素不同水平的影响为A₃＞A₂＞A₁，B₃＞B₂＞B₁，C₁＞C₃＞C₂。表3方差分析发现，A因素3水平间差异有统计学意义（P＜0.05），结合生产实际确定最优水平组合为A₃B₂C₁，即料液比 1 ∶ 10，提取时间60 min，提取次数为1次。

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  表格1 水提工艺因素与水平

  Table 1.Table 1. Factors and levels of water extraction technology

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  表格2 水提工艺正交试验设计与结果

  Table 2.Table 2. Orthogonal experiment design and results of water extraction technology

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  表格3 水提工艺正交试验方差分析结果

  Table 3.Variance analysis results of orthogonal test of water extraction technology

  注：F0.05（2，2）=19.00

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2.2.3 水提工艺的验证试验

对赤芍-牡丹皮（1 ∶ 1）药对最佳水提工艺进行验证试验，结果3次试验中芍药苷含量平均值为6.672%，丹皮酚含量平均值为3.465%，干浸膏得率平均值为26.033%，RSD分别为1.23％，1.33％和1.58%（n=3）。结果显示，提取样品中芍药苷和丹皮酚含量及干浸膏得率接近正交试验中的最大值，表明该提取工艺稳定、可行，可作为赤芍-牡丹皮（1 ∶ 1）药对的水煎煮提取方法。

2.3 醇沉工艺

醇沉法具有纯化中药提取液，除去杂质，减少中药服用剂量等诸多优点，但使用不当会造成中药有效成分的流失，影响中药的有效性和安全性，所以，有必要对中药醇沉的方法进行优化，来适应中药大生产的要求[16]。将赤芍-牡丹皮（1 ∶ 1）药对按优化工艺进行水提，浓缩至一定密度后，缓慢加入95%乙醇至预定含醇量，边加边搅拌，加醇结束后静置，取上清液，即得。

2.3.1 醇沉工艺的单因素试验

取浓缩液，在固定其他因素（醇沉温度为30℃，药液密度固定值为1.15，含醇量固定值为60%，静置时间固定值为36 h）条件下，分别考察药液密度（1.10，1.15，1.20，1.25）、含醇量（30％，45％，60％，75％，90％）、静置时间（ 12，24，36，48，60 h）对芍药苷、丹皮酚的转移率及干膏得率的综合评分指标OD值的影响。结果OD值在相对密度为1.15，含醇量60%，静置48 h时达到最大值，因此各考察因素取值为药液密度为1.15，含醇量为60％，静置时间为48 h。

2.3.2 醇沉工艺的正交试验

本研究以药液密度、含醇量、静置时间为考察因素，以芍药苷、丹皮酚的转移率及干浸膏得率的综合评分指标OD值为考察指标，采用L₉（3⁴）正交试验对药液密度（A）、含醇量（B）、静置时间（C）3因素进行考察。指标成分转移率（%）=指标成分醇沉后的含量/指标成分醇沉前的含量×100%。因素与水平设置见表4，试验设计与结果见表5，方差分析见表6。

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  表格4 醇沉工艺因素与水平

  Table 4.Factors and levels of ethanol precipitation technology

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  表格5 醇沉工艺正交试验设计与结果

  Table 5.Orthogonal experiment design and results of ethanol precipitation technology

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  表格6 醇沉工艺正交试验方差分析结果

  Table 6.Variance analysis results of orthogonal test of ethanol precipitation technology

  注：F0.05（2，2）=19.00

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由表5直观分析可知，各因素对赤芍-牡丹皮（1 ∶ 1）药对醇沉工艺的影响为A＞B＞C，各因素不同水平的影响为A₃＞A₂＞A₁，B₂＞B₃＞B₁，C₃＞C₁＞C₂。由表6方差分析结果可发现，A、B因素3水平间差异有统计学意义（P＜0.05），结合生产实际确定最优水平组合为A₃B₂C₃，即提取液浓缩至相对密度为1.20（30℃），放冷后加入一定量的95%乙醇使药液含醇量为60％，静置60 h，滤过，即得。

2.3.3 醇沉工艺的验证试验

取浓缩至密度为1.20 g·mL^-1的提取液3份，分别缓慢加入一定量95%乙醇使含醇量为60％进行醇沉，边加边搅动，静置60 h后，过滤，进行工艺验证试验。结果3次试验中芍药苷平均转移率为98.376%，丹皮酚平均转移率为97.224%，干浸膏平均得率为16.580%，RSD分别为1.65％，1.32％和1.98%（n=3）。结果显示，芍药苷和丹皮酚转移率高，干浸膏得率和正交试验最大值接近，表明该方法可重现性好，实用可行。

3 讨论

赤芍、牡丹皮同属毛茛科植物，在药理特效方面存在诸多相似之处，两者联合应用能起到协同作用，可以大大提高药物疗效。中药是中华民族的瑰宝，其药理机制比较复杂，往往是多种成分联合发挥作用，本研究选用赤芍、牡丹皮的代表性成分芍药苷和丹皮酚的含量为评价指标，能较好地体现出药材质量；同时，采用干浸膏得率作为评价指标，也与中药多成分联合治病机制相呼应，而Hassan的综合评分法可以科学地将3个评价指标化繁为简，便于试验操作，提高工作效率。水提醇沉法，符合传统中医药特点，先用水将药材中有效成分及杂质一并检出，然后采用醇来净化提取液，与其他提取方法比较更加符合临床实际。

本研究优选的水提醇沉法，能有效提取两味药材中有效成分，且在醇沉过程中损失极低，方法重复性较好，可以为赤芍-牡丹皮（1 ∶ 1）药对更广泛的应用提供参考依据。

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