目的  运用高效液相色谱串联质谱建立测定系统性红斑狼疮（SLE）患者血浆中霉酚酸谷浓度的分析方法。

方法  采用多反应监测，正离子模式，电喷雾离子化，监测离子对为m/z 321.2→159.0（霉酚酸）和m/z 327.2→270.0（内标）。50 μL血浆加入内标后，再经蛋白沉淀处理，采用色谱柱Welch XB-C₁₈（50 mm×2.1 mm, 5 μm）进行液相分离，流动相为2 mmol·L^-1醋酸铵溶液（0.1%甲酸）-乙腈（0.1%甲酸），梯度洗脱，流速为0.8 mL·min^-1，分析时长为3.5 min，进样量为3 μL。20例SLE患者规律口服吗替麦考酚酯分散片达稳态后，于下一次服药前30 min内取全血并分离血浆，处理后进样分析。

结果  霉酚酸在0.25~20 μg·mL^-1范围内线性良好（r=0.997 0），各质控水平准确度为87.5%~114.7%，日内和日间相对标准偏差为4.4%~14.7%，提取回收率为93.7%~110.2%。20例SLE患者霉酚酸谷浓度波动在285~5 297 ng·mL^-1范围内，剂量标准化后患者谷浓度介于285.4~5 297 ng·mL^-1·g^-1，变异系数高达95.9%。

结论  本方法专属性强、灵敏度高、耗时短、前处理简单，可高效精准地监测系统性红斑狼疮患者血浆中霉酚酸谷浓度。

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus, SLE）是一种慢性、全身性自身免疫性疾病，可导致溶血性贫血、淋巴细胞减少症、多系统损害，严重损害身体健康[1]。吗替麦考酚酯（mycophenolate mofetil, MMF）是治疗系统性红斑狼疮的一线方案，为当前临床最常选择品种之一。MMF是霉酚酸（mycophenolic acid, MPA）的酯类前药，口服后被迅速水解为MPA，MPA可抑制T和B淋巴细胞所依赖的嘌呤从头合成从而发挥免疫抑制作用[2]。欧洲抗风湿病联盟、欧洲肾脏协会-欧洲透析和移植协会，以及美国、中国指南均推荐MMF用于Ⅲ型、Ⅳ型疮肾炎（lupus nephritis, LN）的诱导治疗和维持治疗[3-6]。MMF也是LN的一线治疗选择，并在难治性皮肤损害、浆膜炎、神经损伤受累方面使用广泛。MMF在治疗LN的疗效和药物毒性方面不差于环磷酰胺，而且较硫唑嘌呤长期复发率更低[3-4]。

口服固定剂量MMF时MPA药动学呈现相当大的个体间和个体内差异。大量研究发现，MPA暴露水平与SLE疾病活动度相关，维持较高水平12 h血药浓度时间曲线下面积（AUC_0-12h）可显著延长疾病缓解时间或保持低疾病活动度，但同时显著增加感染风险[7-8]；另外，经剂量标准化血浆总MPA AUC₀-2h变异高达53.5%，因此固定剂量方案并不能确保每个LN或其他系统受累患者的临床结局[9]。然而，目前尚无任何指南推荐对SLE常规监测MPA浓度[10]。基于我国人群的MPA药动学及其与SLE疾病活动度、复发率及药物不良事件、感染之间关系的研究亦是空白，高效、准确测定血浆中药物浓度是开展常规MPA监测的前提和基础，因此，本研究拟运用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）建立测定SLE患者血浆中MPA浓度的方法，初步探索患者服用MMF后谷浓度特征，为后续常规开展MPA血药浓度监测研究工作奠定基础。本研究已获得华中科技大学同济医学院附属同济医院医学伦理委员会批准（批件号：TJ-IRB20211167），患者已签署知情同意书。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-20AD型高效液相色谱仪，包括SIL-20ACHT自动进样器和CTO-20AC柱温箱（日本岛津公司）；API 4000型三重四级杆质谱仪，包括电喷雾离子化源和Muti Quant软件（美国AB Sciex公司）；MS105DU型半微量天平（METTLER TOLEDO公司）；Vortex-2 GENIE G560E涡旋混匀器（Scientific Industries公司）；Multifuge X3R型高速冷冻离心机（Thermo Fisher Scientific公司）；PURELAB flex型超纯水机（ELGA公司）；HYQ-3110涡旋混匀器（Crystal industries公司）；HN200多功能氮吹仪（海能仪器公司）。

1.2 试药

MPA对照品（上海甄准生物科技有限公司，批号：ZZS-21-J006-A3，纯度99.01%）；氯氮平对照品（内标，阿拉丁试剂有限公司，批号：A1805046，纯度≥96％）；吗替麦考酚酯分散片（商品名：赛可平，杭州中美华东制药有限公司，批号：211232，规格：250 mg/片）；甲醇、乙腈、乙酸铵均为色谱纯；去离子超纯水由实验室PURELAB Flex纯水系统（ELGA公司）制备。

2 方法与结果

2.1 分析条件

2.1.1 色谱条件

Welch XB-C₁₈色谱柱（50 mm×2.1 mm，5 μm）；流动相为2 mmol·L^-1醋酸铵溶液（0.1%甲酸）（A）-乙腈（0.1%甲酸）（B），采用梯度洗脱（0~0.2 min，30%B；0.2~1.9 min，30%B~ 50%B；1.9~2.0 min，50%B~95%B；2.0~2.7 min，95%B；2.7~2.8 min，95%B~30%B；2.8~3.4 min，30%B）；流速为0.8 mL·min^-1；柱温箱温度为40℃；自动进样器温度为4℃；进样量为3 μL，进样针清洗液为50%甲醇水溶液，体积为400 μL。

2.1.2 质谱条件

采用电喷雾离子化源，正离子模式；离子源电压为5.5 kV，离子源温度为550℃；气帘气为30 psi；碰撞活化解离气为6 psi；雾化气为50 psi；辅助气为55 psi；扫描方式为多反应监测模式；用于定量分析的离子对（m/z）分别为321.2→159.0（MPA）和327.2→270.0（内标）；扫描时间为100 ms；MPA的去簇电压、入口电压、碰撞能、碰撞室出口电压为70，10，46，10 V，内标对应参数分别为100，10，33，10 V。

2.2 样品配置及血浆样品处理

2.2.1 储备液、系列标准溶液和工作液的配置

精密称取对照品MPA和氯氮平10.0 mg，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，制得浓度为1000 μg·mL^-1的MPA储备液和内标储备液。精细吸取MPA储备液，以甲醇逐步稀释，制得浓度为2.5，5，12.5，25，50，100，160，200 μg·mL^-1的系列标准溶液。精密吸取内标储备液，用甲醇-水（50 ∶ 50，v/v）逐步稀释，制得浓度为200 ng·mL^-1的内标工作液。各溶液置于-80℃冰箱保存。                                      

2.2.2 血浆样品处理

精密吸取50 μL血浆样品，加入20 μL内标工作液，涡旋10 s混匀，再加入200 μL乙腈沉淀蛋白，涡旋震荡5 min，4℃条件下离心（12 000×g）10 min，离心结束后取上清液100 μL进样分析。

2.3 专属性考察

取6份来自不同受试者的空白血浆、最低定量限的血浆样品、患者服药前30 min内采集分离的血浆，按“2.2.2”项下方法处理，进样分析，记录色谱图。结果表明，待测物及内标峰型良好，出峰时间分别为1.8 min和0.7 min，均无内源性物质干扰测定。空白血浆、定量下限样品及患者典型色谱图见图1。

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  图1 图1 典型色谱图

  Figure 1.Figurg 1. Typical chromatograms

  注：A. 空白血浆；B. 最低定量限血浆样品；C. SIE患者服药前30 min内采集分离的血浆样品；1. MPA；2. 内标

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2.4 标准曲线与定量下限

精密量取“2.2.1”项下MPA的系列标准溶液，按1 ∶ 10（v/v）的比例加入人空白血浆，配制成浓度为0.25，0.5，1.25，2.5，5，10，16，20 μg·mL^-1的标准曲线溶液，按“2.2.2”项下方法处理，进样分析。以MPA和内标的峰面积比值为纵坐标（Y），MPA浓度为横坐标（X，μg·mL^-1），采用加权最小二乘法进行回归运算，计算得标准曲线的回归方程：Y=4.711 00×10^-4X+ 0.038 20（r=0.997 0），结果表明，MPA在0.25~ 20 μg·mL^-1范围内线性关系良好，定量下限为0.25 μg·mL^-1。

2.5 精密度与准确度

精密量取“2.2.1”项下MPA定量下限、低、中、高质控样品（2.5，7.5，40，150 μg·mL^-1），按1 ∶ 10（v/v）的比例加入人空白血浆，配制成浓度为0.25，0.75，4，15 μg·mL^-1的定量下限及低、中、高3个浓度的血浆样品，按“2.2.2”项下方法处理，连续3 d制备和处理样品，每个浓度制备5份，进样分析，计算批内、批间精密度和准确度，结果见表1。结果显示，定量下限及低、中、高质控样品方法精密度和准确度良好。

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  表格1 人血浆中MPA的精密度和准确度 (%，n=5)

  Table 1.Precision and accuracy of mycophenolic acid in human plasma (%, n=5)

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2.6 回收率与基质效应

分别精密量取低、中、高浓度血浆质控样品（0.75，4，15 μg·mL^-1）50 μL，按“2.2.2”项下方法处理，进样分析，得待测物和内标峰面积A1。分别精密量取低、中、高质控样品（7.5，40，150 μg·mL^-1），用纯甲醇稀释，获得溶媒质控样品（0.75，4，15 μg·mL^-1），各吸取50 μL，再加入200 μL内标，在37℃条件下氮气吹干，获得含药残渣；再取50 μL来源于6份不同人的空白血浆，加入与内标工作液等体积的纯乙腈，按“2.2.2”项下方法处理，上清液全部加入含药残渣，涡旋混匀1 min，进样分析，得待测物和内标峰面积A2。分别精密吸取50 μL溶媒质控样品，按“2.2.2”项下方法处理，进样分析，得待测物和内标峰面积A3。血浆质控品和溶媒质控样品均平行制备6份，根据A1/A2计算待测物和内标的提取回收率，再根据A2/A3计算待测物和内标的基质效应以及相对基质效应。结果显示，MPA及内标回收率良好，基质效应对测定的干扰在允许范围内，见表2。

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  表格2 人血浆中MPA的基质效应和提取回收率（%，n=6）

  Table 2.Matrix effect and extract recovery of mycophenolic acid in human plasma (%, n=6)

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2.7 样品稳定性

考察低、高浓度血浆质控样品（0.75，15 μg·mL^-1）在-20℃反复冻融3次（室温下解冻和-20℃冷冻）、-80℃放置90 d、经处理后在4℃进样器中放置24 h、室温下放置24 h条件下的稳定性，每一浓度平行处理3份。结果表明，MPA血浆质控样品在上述条件下稳定性良好，见表3。

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  表格3 人血浆中MPA稳定性（%，n=3）

  Table 3.Stability of mycophenolic acid in human plasma (%, n=3)

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2.8 临床应用

20例SLE患者经验性使用吗替麦考酚酯分散片进行免疫抑制治疗，剂量依据患者病情确定，所有患者稳定使用时间超过7 d，并于早晨服药前采集静脉血2 mL，置于EDTA抗凝管，12 h内在（1 800×g）下离心10 min，分离血浆，置于-80℃保存。运用上述建立方法测定患者血浆中MPA浓度，各患者性别、年龄、服药方案、谷浓度等数据见表4。结果显示，患者谷浓度（C₀）波动在0.29~5.30 μg·mL-1范围内，剂量标准化后患者谷浓度（MPA谷浓度/每日MMF总剂量，C₀/D）的变异系数高达95.9%。

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  表格4 系统性红斑狼疮患者用药情况及MPA监测结果（n=20）

  Table 4.Medication regiments and monitoring results of patients with SLE（n=20）

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3 讨论

本文建立了LC-MS/MS法测定人血浆中总MPA谷浓度的方法，血浆样品采用蛋白质沉淀剂预处理，采用电喷雾离子源、多反应监测模式进行定量分析，血浆中的内源性物质不影响待测物的测定。本方法具有特异性好、准确、选择性强的特点，符合生物样品定量测定相关要求[11-12]，可用于MPA血浆谷浓度的监测。

既往测定血浆中霉酚酸浓度的方法主要包括免疫法和色谱法。免疫法由于成本高、代谢产物对测定存在干扰，放在血药浓度监测、真实世界的临床研究应用过程中受到一定的限制；而色谱法具备灵敏度高、选择性强、特异性好等诸多优点，被越来越多的研究者所采用[13]。LC-MS/MS法是色谱法中最好的一类方法，借助同位素内标可充分消除基质效应，但实际上霉酚酸稳定同位素内标价格昂贵，成本高，相比之下，氯氮平理化性质稳定，提取回收率高，成本较低[14]，本文结果亦证明MPA基质效应在可接受范围内，血浆体积小、处理方法简单，同时分析时间更短，不劣于其他定量分析方法[15]。

MPA类药物作为三联免疫抑制方案的重要组成部分，常与钙调磷酸酶抑制、糖皮质激素联合，用于预防移植患者排斥反应的发生。对于肾移植，其体内浓度与短期、长期临床结局的关系已获得较为全面的认识，并获得国际广泛共识：监测MPA浓度可显著降低排斥反应和不良事件的发生，推荐AUC_0-12h维持在30~60 μg·h·mL^-1 [16]。MPA呈非线性药动学，个体间和个体内差异均很大，最近有学者总结欧美人群的大量研究后得出结论，MPA暴露水平与SLE疾病活动度密切相关，固定剂量方案并不能确保临床结局，基于目标浓度调整MPA剂量较标准固定剂量方案更有利于疾病控制，同时显著降低药物经济成本，呼吁LN患者MPA AUC_0-12h维持在35~45 μg·h·mL^-1或C₀＞3 μg·mL^-1 [7-8,17]；然而，针对SLE其他亚型并未提供监测指标和参考范围，且尚无任何指南要求对SLE常规监测MPA浓度，但很多国外学者推荐在治疗早期或判定治疗失败前进行血药浓度监测，并呼吁完善相关研究。

本研究通过少量样本观察证实MPA C₀个体间差异较大，但能否直接参考当前少量的国外研究提供的参考范围进行方案调整值得商榷，因为不同人种的疾病特征、药物代谢和耐受性差异，理想的药动学监测指标及对应不同SLE亚型的参考范围均需要更大范围的探索和验证，未来将在本方法基础上开展临床试验，基于MPA血药浓度监测揭示中国SLE患者使用MPA类药物的体内暴露、疗效和安全性方面的规律，为临床安全合理用药提供参考。

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