目的  建立不同产地威灵仙中9个成分含量同步检测方法，筛选影响其质量的差异标志物，对其质量差异性进行评价。

方法  对8省16个批次威灵仙样品进行回流提取，提取物采用HPLC法检测；采用化学识别模式和加权TOPSIS法建立威灵仙质量优劣评价模型，对其质量差异性进行综合评价。

结果  灵仙新苷、虎掌草皂甙D、威灵仙皂甙C、虎掌草皂苷B、常春藤皂苷元、齐墩果酸、3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黄酮、橙皮素和芒柄花素分别在1.27~31.75、4.48~112.00、7.35~183.75、3.69~92.25、6.16~154.00、20.95~523.75、0.58~14.50、0.39~9.75和0.26~6.50 µg/mL范围内线性关系良好（r＞0.999 0），平均加样回收率为96.91%~100.12%，RSD为0.71%~1.53%（n=9）；16批样品聚为3类；齐墩果酸、威灵仙皂甙C、灵仙新苷和常春藤皂苷元可能是影响威灵仙产品质量主要潜在标志物；加权TOPSIS法分析结果显示16批威灵仙质量评价贴近度在0.097 8~0.818 2之间，其中S13最大（0.818 2）。

结论  建立的威灵仙中9种成分定量分析方法，操作简便、结果准确；化学计量学及加权TOPSIS法可用于评价其质量差异性。

威灵仙为毛茛科植物威灵仙Clematis chinensis Osbeck、棉团铁线莲Clematis hexapetala Pall.或东北铁线莲Clematis manshurica Rupr.的干燥根和根茎，其中威灵仙分布于湖南、江西、福建、云南、贵州、江苏、浙江、安徽、四川、湖北等地，棉团铁线莲分布于黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古、河北、山西、陕西、山东等地，东北铁线莲分布于黑龙江、吉林、辽宁等东北地区[1-2]。威灵仙祛风湿、通经络，主要用于风湿痹痛、肢体麻木、筋脉拘挛、屈伸不利等病症的治疗[3-4]。威灵仙主要含有皂苷类、黄酮及多元酚类、木质素类、生物碱类等成分[5-8]，具有抗肿瘤[9]、抗炎[10]、镇痛 [11]、平痉[12-13]等多种药理作用。威灵仙收录于《中国药典（2020年版）》，该标准仅对齐墩果酸进行了定量研究[3]。相关文献也仅限1~2个成分的含量测定[1,14]。与单一成分定量控制相比较，HPLC多指标成分更能较为全面地反映药材的整体质量，同时一测多评技术能够有效解决多指标成分对照品使用量大、检验成本过高带来的不足，促进了多指标成分定量控制方法的普及应用。主成分分析（principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）等化学识别模式通过降维分析，将多个变量转化为少数几个综合变量，挖掘复杂数据间存在的关联关系，能够有效查找影响威灵仙产品质量主要潜在标志物，分析结果直观可靠[15]。加权TOPSIS法充分利用原始数据的信息，先将原始数据无纲化处理，并按照各指标权重大小合理赋权，以评价对象与理想目标的欧氏距离为标尺，获得各评价对象与最优方案的相对接近程度，实现对各评价对象质量优劣排序，准确性高[16]。中药质量受多种因素影响，其中产地是其中的关键因素之一，为确保其临床疗效，本研究收集湖南、江西、福建、云南、贵州、江苏、浙江、安徽8省16批毛茛科植物威灵仙药材，采用高效液相一测多评（high performance liquid chromatography-quantitative analysis of multi-components by single marker，HPLC-QAMS）同时测定其所含灵仙新苷、虎掌草皂甙D、威灵仙皂甙C、虎掌草皂苷B、常春藤皂苷元、齐墩果酸、3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黄酮、橙皮素和芒柄花素含量，并采用化学计量学[15]和加权TOPSIS法[16]对不同产地威灵仙质量进行评价，旨为威灵仙道地研究提供数据支撑，也为威灵仙质量差异性评价方法提供借鉴。

1 材料

1.1 主要仪器

L-2000型高效液相色谱仪（日本日立公司）；Agilengt 1100型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；AE200型电子天平（德国梅特勒-托利多公司）；G-100S型超声波清洗机（深圳市歌能清洗设备有限公司）。

1.2 主要药品与试剂

对照品：常春藤皂苷元（批号：111733-201205，纯度98.3%）；齐墩果酸（批号：110709-202109，纯度95.8%）购自中国食品药品检定研究院；3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黄酮（批号：PRF21110341，纯度99.7%）、橙皮素（批号：PRF8121921，纯度99.4%）、芒柄花素（批号：PRF8091225，纯度99.9%）均购自成都普瑞法科技开发有限公司；灵仙新苷（批号：HY-N4232-151818，纯度99.0%）、虎掌草皂甙D（批号：HY-107236-239517，纯度99.0%）、威灵仙皂甙C（批号：HY-N5071-365703，纯度98.0%）均购自上海皓元生物医药科技有限公司；虎掌草皂苷B（上海陶术生物科技有限公司，批号：TN4230-223563，纯度98.4%）；乙腈和磷酸为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

威灵仙样品经首都医科大学附属北京积水潭医院中药房张蕊副主任药师，按《中国药典（2020年版）》一部鉴定，均为毛茛科植物威灵仙Clematis chinensis Osbeck的干燥根和根茎，系正品，其产地及采收时间信息见表1。

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  表格1 威灵仙来源信息

  Table 1.Source information of Clematidis radix et rhizome

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2 方法与结果

2.1 混合对照品溶液的制备

取各对照品适量，用70%甲醇混匀制成含灵仙新苷0.254 mg/mL、虎掌草皂甙D 0.896  mg/ mL、威灵仙皂甙C 1.470 mg/mL、虎掌草皂苷B 0.738  mg/mL、常春藤皂苷元1.232 mg/ mL、齐墩果酸4.190 mg/mL、3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黄酮0.116 mg/mL、橙皮素0.078 mg/mL和芒柄花素0.052 mg/mL的对照品贮备液；精密吸取对照品贮备液1 mL，置20 mL量瓶中，用70%甲醇定容，摇匀，即得混合对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备

将威灵仙药材粉碎过筛，取威灵仙粉末约1.0  g，精密加入70%甲醇25 mL，称定重量，超声（功率：300 W，频率：40 kHz）45 min，冷却，补重，摇匀，静置，0.22 µm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。

2.3 色谱条件

色谱柱：Waters Symmetry C₁₈柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：0.05%磷酸（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0~12 min，15.0% B；12~29  min，15.0%→36.0% B；29~41 min，36.0%→68.0% B；41~52 min，68.0%→85.0%  B；52~60 min，85.0%→15.0% B）；检测波长：0~41 min、210 nm（灵仙新苷、虎掌草皂甙D、威灵仙皂甙C、虎掌草皂苷B、常春藤皂苷元和齐墩果酸），41~60 min、300 nm（3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黄酮、橙皮素和芒柄花素）；柱温：30  ℃，流速：1.0 mL/min，进样量：10 µL。对照品溶液和供试品溶液的HPLC色谱图显示灵仙新苷、虎掌草皂甙D、威灵仙皂甙C、虎掌草皂苷B、常春藤皂苷元、齐墩果酸、3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黄酮、橙皮素和芒柄花素色谱峰间无干扰，供试品溶液中9个成分吸收峰的位置与对照品基本一致，理论板数按各成分计均不低于4 500。具体见图1。

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  图1 HPLC色谱图

  Figure 1.HPLC chromatogram

  注：A. 混合对照品；B. 供试品；C. 空白溶剂（70%甲醇）；1. 灵仙新苷；2. 虎掌草皂甙D；3. 威灵仙皂甙C；4. 虎掌草皂苷B；5. 常春藤皂苷元；6. 齐墩果酸；7. 3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黄酮；8. 橙皮素；9. 芒柄花素。

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2.4 方法学考察

2.4.1 标准曲线绘制

分别精密量取“2.1”项下对照品贮备液，置不同的量瓶中，用70%甲醇稀释8、10、20、40、100、200倍制成系列浓度标准溶液。按“2.3”项下色谱条件进样测定，以对照品的浓度为横坐标（X，μg/mL）、峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，并计算回归方程，结果见表2。结果表明，灵仙新苷、虎掌草皂甙D、威灵仙皂甙C、虎掌草皂苷B、常春藤皂苷元、齐墩果酸、3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黄酮、橙皮素、芒柄花素9个成分在各自浓度范围内线性关系良好。

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  表格2 9个指标性成分的标准曲线及线性范围

  Table 2.Calibration curves and linear range for 9 constituents

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2.4.2 精密度试验

取1份供试品溶液（编号：S1），按“2.3”项下色谱条件连续进样6次，计算得灵仙新苷、虎掌草皂甙D、威灵仙皂甙C、虎掌草皂苷B、常春藤皂苷元、齐墩果酸、3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黄酮、橙皮素和芒柄花素峰面积的RSD分别为1.14%、1.05%、0.91%、1.22%、1.04%、0.55%、1.43%、1.65%、1.52%（n=6），结果表明仪器精密度良好。

2.4.3 稳定性试验

取1份供试品溶液（编号：S1），室温放置，分别于0、4、8、12、16、20、24 h取样，按“2.3”项下色谱条件进样测定，计算得灵仙新苷、虎掌草皂甙D、威灵仙皂甙C、虎掌草皂苷B、常春藤皂苷元、齐墩果酸、3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黄酮、橙皮素和芒柄花素峰面积的RSD分别为1.52%、1.37%、1.03%、1.41%、1.19%、0.71%、1.65%、1.71%、1.79%（n=7），结果表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.4 重复性试验

取威灵仙样品粉末（编号：S1）6份，按“2.2”项下方法制成供试品溶液，再按“2.3”项下色谱条件进样测定，计算得灵仙新苷、虎掌草皂甙D、威灵仙皂甙C、虎掌草皂苷B、常春藤皂苷元、齐墩果酸、3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黄酮、橙皮素和芒柄花素的平均含量分别为0.288、1.032、2.143、0.766、1.731、6.332、0.126、0.081、0.057 mg/g，RSD分别为1.94%、1.79%、1.62%、1.83%、1.65%、1.17%、1.89%、1.96%、1.91%（n=6），结果表明该法重复性良好。

2.4.5 回收率试验

取威灵仙样品粉末（编号：S1）9份，每份约0.5  g，精密称定，按已知各成分含量80%、100%、120%的比例加入混合对照品溶液（每mL含灵仙新苷0.147 mg、虎掌草皂甙D 0.521 mg、威灵仙皂甙C 1.056 mg、虎掌草皂苷B 0.384 mg、常春藤皂苷元0.859 mg、齐墩果酸3.072 mg、3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黄酮0.064  mg、橙皮素0.043 mg、芒柄花素0.029 mg），再按“2.2”项下方法制成加样回收率供试品溶液，每个水平制备3份。按“2.3”项下色谱条件进样测定，9个成分的平均加样回收率分别为灵仙新苷98.16%、虎掌草皂甙D 99.08%、威灵仙皂甙C 100.12%、虎掌草皂苷B 97.87%、常春藤皂苷元99.10%、齐墩果酸98.61%、3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黄酮98.08%、橙皮素96.91%、芒柄花素97.80%，RSD分别为1.21%、虎掌草皂甙D 1.08%、威灵仙皂甙C 0.71%、虎掌草皂苷B 1.26%、常春藤皂苷元1.18%、齐墩果酸0.92%、3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黄酮1.37%、橙皮素1.14%、芒柄花素1.53%（n=9），结果表明该法回收率良好。

2.5 相对校正因子计算

取6份混合对照品溶液，按“2.3”项下色谱条件进样测定，采用多点校正法，以常春藤皂苷元为内参物，计算灵仙新苷、虎掌草皂甙D、威灵仙皂甙C、虎掌草皂苷B、齐墩果酸的相对校正因子（f）；以橙皮素为内参物，计算3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黄酮、芒柄花素的f值[17-18]。公式如下：

式中ρ和A代表相质量浓度和峰面积，下标i和s代表内参物和其他待测成分，结果见表3。

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  表格3 多点校正法的 f 值

  Table 3.The f value of multipoint correction method

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2.6 f 值的耐用性考察

选择HPLC色谱系统和色谱柱、流速、柱温等条件，按“2.3”项下色谱条件进样测定，考察不同色谱条件的改变对f值的影响，结果见表4，表明f值的耐用性良好。

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  表格4 f 值的耐用性考察结果

  Table 4.Results of durability test of f value

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2.7 相对保留时间考察

考察不同型号高效液相色谱仪和色谱柱对相对保留时间的影响，结果见表5，显示该法可用于威灵仙中9个成分色谱峰的定位。

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  表格5 相对保留时间的考察结果

  Table 5.The investigation results of relative retention time

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2.8 样品测定

取编号S1~S16威灵仙样品，按“2.2”项方法，各批次平行制备3份供试品溶液，再按“2.3”项下色谱条件进样检测，运用外标法（external standard method，ESM）计算灵仙新苷、虎掌草皂甙D、威灵仙皂甙C、虎掌草皂苷B、常春藤皂苷元、齐墩果酸、3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黄酮、橙皮素和芒柄花素的含量，再利用QAMS法，以常春藤皂苷元为参照物，计算灵仙新苷、虎掌草皂甙D、威灵仙皂甙C、虎掌草皂苷B和齐墩果酸的含量；以橙皮素为参照物，计算3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黄酮和芒柄花素的含量，最后运用SPSS 26.0软件中独立样本t检验法对各组分2种方法所得数据进行分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。结果显示2种方法所得含量差异不明显（P＞0.05），但批次间含量差异较大，具体见表6。

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  表格6 16批威灵仙药材中9个指标成分的含量（n=3）

  Table 6.Contents of 9 indicative compounds in 16 batches of Clematidis radix et rhizoma (n=3)

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2.9 浸出物、总灰分、酸不溶性灰分检测

浸出物、总灰分和酸不溶性灰分分别参照《中国药典（2020年版）》四部通则2201浸出物测定法、2302灰分测定法进行测定[19]。结果见表7。

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  表格7 威灵仙中浸出物、总灰分、酸不溶性灰分检测结果（%，n=2）

  Table 7.Test results of extract, total ash and acid-insoluble ash in Clematidis radix et rhizoma (%, n=2)

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2.10 化学计量学分析

以16批威灵仙中灵仙新苷、虎掌草皂甙D、威灵仙皂甙C、虎掌草皂苷B、常春藤皂苷元、齐墩果酸、3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黄酮、橙皮素和芒柄花素QAMS含量、浸出物、总灰分和酸不溶性灰分检测结果为变量，借助SIMCA 14.1软件对16×12矩阵数据进行PCA分析，结果16批威灵仙样品大致分成3组，江苏、浙江和安徽样品位于横轴上方，云南和贵州样品位于椭圆图左下方，湖南、江西和福建样品位于椭圆图右下方，所有检测数据无异常（所有数据点均在95%置信区间内）（图2）。为探索引起样品分组的主要因素，在进一步PCA分析基础上运行OPLS-DA程序，结果模型参数R²X＝0.953、R²Y＝0.875、Q²＝0.824，均大于0.5（其中R²X和R²Y分别表示所建模型对X和Y矩阵的解释率，Q²表示模型的预测能力）[20]。化学计量学分析中变量重要性投影（variable importance in projection，VIP）值可作为质量差异因子的依据，各成分的VIP值依次为1.255 1、0.848 3、1.289 0、0.932 9、1.173 0、2.095 0、0.818 5、0.281 8、0.222  1、0.743 4、0.148 7和0.187 3，以1为VIP的阈值，筛选出齐墩果酸、威灵仙皂甙C、灵仙新苷和常春藤皂苷元作为质量差异因子。OPLS-DA分析结果图见图3和图4。

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  图2 PCA得分图

  Figure 2.Score plot of PCA

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  图3 OPLS-DA得分图

  Figure 3.Score plot of OPLS-DA

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  图4 化学计量学分析中VIP图

  Figure 4.VIP plot in chemometrics analysis

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2.11 加权TOPSIS数据无纲化处理

灵仙新苷、虎掌草皂甙D、威灵仙皂甙C、虎掌草皂苷B、常春藤皂苷元、齐墩果酸、3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黄酮、橙皮素、芒柄花素和浸出物数据差异较大，根据公式（1）进行无纲化处理；总灰分和酸不溶性灰分属于越小越优型指标，根据公式（2）处理，结果见表8。

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  表格8 无纲化处理结果

  Table 8.Results of unstructured treatment

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2.12 加权TOPSIS加权决策矩阵和最优、最差向量计算

以OPLS-DA中灵仙新苷、虎掌草皂甙D、威灵仙皂甙C、虎掌草皂苷B、常春藤皂苷元、齐墩果酸、3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黄酮、橙皮素、芒柄花素、浸出物、总灰分和酸不溶性灰分的VIP值（1.255 1、0.848 3、1.289 0、0.932 9、1.173  0、2.095 0、0.818 5、0.281 8、0.222 1、0.743 4、0.148  7和0.187  3）为权重，将无纲化处理的数据与对应权重相乘，得加权决策矩阵（表9）。以矩阵中各成分的最大值为最优向量（Z_c⁺），最小值为最差向量（Z_c^-）。

2.13 质量优劣排序

在加权TOPSIS评价应用中，通常以相对贴近度（J_b）为指标来评价样品的质量，J_b值越大，被评价样品质量越优[21]。按最优向量欧氏距离（D_b⁺）、最差向量欧氏距离（D_b^-）、相对贴近度（J_b）计算公式分别计算16批威灵仙样品的D_b⁺、D_b^-和J_b值，并根据J_b值的大小对样品质量进行排序（表10）。结果江西、福建和湖南产地威灵仙药材的J_b值高于其他产地，即江西、福建和湖南产地的威灵仙药材排名靠前。

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  表格9 加权决策矩阵结果

  Table 9.Results of weighted decision matrix

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  表格10 威灵仙药材质量评价结果

  Table 10.Quality evaluation results of Clematidis Radix et Rhizoma

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3 讨论

3.1 制样方法的确定

本试验提取供试品时，以灵仙新苷、虎掌草皂甙D、威灵仙皂甙C、虎掌草皂苷B、常春藤皂苷元、齐墩果酸、3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黄酮、橙皮素和芒柄花素的综合提取率为指标，考察了70%乙醇、乙醇、70%甲醇、甲醇和水超声提取30、45、60 min，提取次数考察1、2、3次。结果以70%甲醇超声提取45 min，重复提取2次时，以上9个成分的色谱信息最丰富，杂质干扰最小，峰形与分离度最好。

3.2 检测波长的确定

威灵仙中灵仙新苷、虎掌草皂甙D、威灵仙皂甙C、虎掌草皂苷B、常春藤皂苷元、齐墩果酸、3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黄酮、橙皮素和芒柄花素紫外吸收主要集中在200~400 nm波段。在采用紫外扫描法对混合对照品溶液检测时，综合9个成分紫外吸收及相关文献，分别采用不同波长对比考察，结果筛选出“2.3”项下建立的色谱条件检测时，灵仙新苷、虎掌草皂甙D、威灵仙皂甙C、虎掌草皂苷B、常春藤皂苷元、齐墩果酸、3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黄酮、橙皮素、芒柄花素色谱峰信号响应值大、峰对称度好、基线较平。

3.3 指标成分的选择

威灵仙主要含有皂苷类、黄酮及多元酚类、木质素类、生物碱类等成分，其中皂苷类和黄酮类为其主要活性成分，灵仙新苷、虎掌草皂甙D、威灵仙皂甙C、虎掌草皂苷B、常春藤皂苷元和齐墩果酸为其皂苷类主要成分，对炎症、动脉粥样硬化及心肌梗死等均具有确切疗效，与游离多糖结合能够发挥抗肿瘤作用[9]，灵仙新苷能有效拮抗人肿瘤坏死因子-α诱导的炎症和细胞毒性，发挥抗炎作用[22]；齐墩果酸通过缓解炎症过程中产生的一氧化氮，减低对机体正常组织的损害[23]；3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黄酮、橙皮素和芒柄花素为其黄酮类主要成分，具有明显的抗炎镇痛作用 [5]，橙皮素能够有效治疗以帕金森为代表的迟发性运动障碍疾病[24]；芒柄花素可通过磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B通路缓解β淀粉样蛋白诱发的神经细胞损伤[25]。故本研究选取上述9种化合物作为HPLC多指标定量控制成分。

3.4 评价结果分析

在建立的HPLC条件下，本试验首先进行了ESM方法学验证，结果灵仙新苷、虎掌草皂甙D、威灵仙皂甙C、虎掌草皂苷B、常春藤皂苷元、齐墩果酸、3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黄酮、橙皮素和芒柄花素在各自范围内呈现良好的线性关系（r＞0.999 0）；精密度和重复性试验结果良好，供试品溶液24 h内稳定性；测得各成分的平均加样回收率及RSD均符合《中国药典（2020年版）》四部通则9101的要求；分别采用QAMS和ESM对比了16批威灵仙所含灵仙新苷、虎掌草皂甙D、威灵仙皂甙C、虎掌草皂苷B、常春藤皂苷元、齐墩果酸、3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黄酮、橙皮素和芒柄花素的含量差异，结果2种方法未见显著差异，但每一成分批次间存在一定的差异。化学计量学对16批威灵仙中9个成分QAMS法含量数据的分析中PCA得分图显示各批次散点不够集中，验证了各批次间质量差异较大，相邻产区的威灵仙质量较为相近；同时VIP＞1的组分有齐墩果酸、威灵仙皂甙C、灵仙新苷和常春藤皂苷元，表明以上4个成分可作为其潜在的质量差异标志物；加权TOPSIS法结果显示相对贴近度J_b值在0.097 8~0.818 2之间，表明各批次间威灵仙质量差异较大，其中S13批次威灵仙质量最优（J_b值为0.818 2），江西、福建和湖南产地威灵仙药材的J_b值高于其他产区，提示江西、福建和湖南产地的威灵仙药材的质量优于其他产区。本研究样品均来源于毛茛科植物威灵仙，样品种属、采集地和采集批次存在一定局限，后续将进一步收集棉团铁线莲和东北铁线莲，开展各评价指标与样品种属间差异研究；扩大威灵仙收集产地和批次，对同一产地不同采收季节样品开展研究，同时收集产地土壤、气候等关键参数，挖掘关键参数与产品内在质量间的关联关系，进一步为威灵仙产品质量提升和道地研究提供数据支持。

3.5 小结

本试验建立的威灵仙中多指标成分定量质控方法，简便准确、检验成本小，易推广；化学计量学联合加权TOPSIS法可用于威灵仙的质量差异性分析评价，为其资源开发及其道地性研究提供借鉴。

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