目的  采用响应面法对板蓝根产地加工与炮制一体化工艺进行优化。

方法  以板蓝根中(R,S)-告依春、靛蓝、靛玉红及4种苷类活性成分含量为评价指标，选取新鲜药材含水量（%）、干燥温度（℃）和切制规格（mm）3个关键工艺参数，通过Box-Behnken响应面试验设计对板蓝根产地加工与炮制一体化工艺进行系统优化。

结果  板蓝根产地加工炮制一体化最佳工艺条件为：含水量40.38%，切制规格2.54  mm，干燥温度为58.57℃。

结论  本研究建立的板蓝根产地加工与炮制一体化工艺方法操作简便、重现性好，为板蓝根规范化产地加工提供了可靠的技术支持，具有重要的实际应用价值。

板蓝根为菘蓝（Isatis indigotica Fortune.）的干燥根，属于十字花科植物。秋季采挖，除去泥沙后晒干。性味苦、寒，归属心、胃经，具有清热解毒、凉血利咽之功效，主治外感发热，温病初起，咽喉肿痛，温毒发斑，痄腮，丹毒，痈肿疮毒[1]。从古至今，在诸多文献中对板蓝根炮制加工方法都有记载：宋代《小儿卫生总微论方》记载为先用麦麸炒至黄色，然后洗净晒干的方法；明代《普济方》记载焙干法；现行炮制加工方法为《中国药典（2020年版）》，除去杂质，洗净，润透，切厚片，干燥[1]。但对于润透程度，切片厚度，干燥温度并没有严格标准，不利于板蓝根质量控制[2]，在此基础上，本试验以(R,S)-告依春、靛蓝、靛玉红及4种苷类化学成分含量作为考察指标，运用星点设计响应面法将板蓝根产地加工和炮制合二为一，优选板蓝根产地加工一体化工艺，并探讨产地加工炮制一体化对板蓝根饮片加工的优势，为饮片的质量控制和临床规范应用提供依据。

1 材料

1.1 主要仪器

LC-20A型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；FA-2004型十万分之一电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；SHZ-D（III）型循环水多用真空泵（巩义市科瑞仪器有限公司）；RE-2000A型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；GZX-9070MBE干燥箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；KQ-50DE超声仪（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 主要药品与试剂

板蓝根样品于2023年10月采自甘肃省民乐县六坝镇洋胡滩种植基地，经河西学院中药资源与鉴定专家王玉梅副教授鉴定为十字花科（Brassicaceae）菘蓝属植物菘蓝（Isatis indigotica Fortune.）的干燥根；对照品尿苷（批号：N10M11W109430，纯度≥98%）、鸟苷（批 号：J09GB154303，纯度≥98%）、腺苷（批号：J08HB173656，纯度≥99%）、胞苷（批 号：T16J7X9000，纯度≥98%）、(R,S)-告依春（批 号：Z27N11X₃2307，纯度≥98%）均购自上海源叶生物科技有限公司；对照品靛蓝（批 号：1221A026，纯度≥98%）和靛玉红（批 号：702B022，纯度≥98%）购自北京索莱宝科技有限公司；甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 指标成分的含量测定

2.1.1 色谱条件

①核苷类及(R,S)-告依春的色谱条件。采用Diamonsil C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以甲醇（A）-0.3%甲酸水溶液（B）为流动相进行梯度洗脱（0~14 min，5% A；14~24  min，5%→10% A；24~35 min，10%→20%  A；35~40 min，20%→55% A）；流速：1.0 mL/min；柱温：30℃；检测波长：254 nm；进样量：10 μL。

②靛蓝和靛玉红的色谱条件。采用Diamonsil C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以甲醇（A）-0.8%磷酸水溶液（B）为流动相进行梯度洗脱（0~10  min，25% A；10~20  min，25%→45% A；20~22 min，45%→59% A；22~40 min，59%→71% A；40~42 min，71%→75% A；42~60 min，75%→85% A）；流速：1.0  mL/min；柱温：30℃；检测波长：280 nm；进样量10 μL[3]。

2.1.2 溶液的制备

①混合对照品溶液的制备。精密称定胞苷、尿苷、腺苷、鸟苷、(R,S)-告依春对照品各适量，置于50 mL量瓶中，加入75%甲醇超声（功率：250 W，频率：30 kHz）溶解，冷却至室温后定容至刻度，摇匀，制得各成分浓度分别为胞苷0.010 1 mg/mL、尿苷0.013 8 mg/mL、腺苷0.016 7 mg/mL、鸟苷0.017 1 mg/mL、(R,S)-告依春0.012 0 mg/mL的混合对照品溶液。

精密称定靛蓝、靛玉红对照品各适量，置于50 mL量瓶中，加入三氯甲烷超声（功率：250 W，频率：30 kHz）溶解，冷却至室温后定容至刻度，摇匀，制得靛蓝和靛玉红浓度分别为0.014 9、0.020 5 mg/mL的混合对照品溶液。

②供试品溶液的制备。各核苷类化合物及(R,S)-告依春测定用供试品溶液：精密称取板蓝根粉末（过4号筛）1.0 g，置于50 mL具塞锥形瓶中，准确加入75%甲醇25 mL，精密称定总质。30℃条件下超声（功率：250  W，频率：30 kHz）提取1.5 h。提取完毕后取出，室温冷却30  min，再次精密称定总质量，冷却至室温后用75%甲醇补足减失的重量。经0.45 μm微孔滤膜初滤后，取续滤液过0.22 μm有机相微孔滤膜，即得。

靛蓝和靛玉红测定用供试品溶液：精密称取板蓝根粉末（过60目筛）5.0 g，置于100 mL圆底烧瓶中，加入70%乙醇溶液50 mL，85℃水浴中回流提取2次，每次1 h。0.45 μm微孔滤膜过滤后，合并滤液，挥去乙醇，用三氯甲烷萃取2次，每次25 mL。合并三氯甲烷萃取液，转移至50 mL量瓶中，用三氯甲烷定容至刻度，经0.22 μm有机相微孔滤膜，即得[4]。

2.1.3 系统适用性试验

精密量取各混合对照品溶液和供试品溶液按“2.1.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图（图1）。结果表明各色谱峰分离度均大于1.5，理论板数符合规定，基线平稳，该方法分离效果良好，系统适用性符合要求。

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  图1 HPLC色谱图

  Figure 1.HPLC chromatogram

  注：A. 核苷类及(R,S)-告依春对照品；B. 核苷类及(R,S)-告依春供试品；C. 靛蓝和靛玉红对照品；D. 靛蓝和靛玉红供试品；1. 胞苷；2. 尿苷；3.  腺苷；4. 鸟苷；5. (R,S)-告依春；6. 靛蓝；7. 靛玉红。

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2.1.4 线性关系考察

将上述混合对照品溶液分别梯度稀释为5个不同浓度（浓度范围见表1），按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，每次10 μL，记录各待测成分色谱峰面积，以峰面积为纵坐标，进样质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程，结果见表1。可见，各待测成分在相应进样范围内线性关系良好。

取“2.1.2”项下制备的混合对照品溶液，分别用相应溶剂，核苷类及(R,S)-告依春用75%甲醇，靛蓝和靛玉红用三氯甲烷，梯度稀释制备5个不同浓度的系列对照品溶液。按照“2.1.1”项下色谱条件进行测定，记录各待测成分色谱峰面积，以对照品浓度（X，μg/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归分析。表1结果表明，各待测成分在测定浓度范围内线性关系良好，r均大于0.995 0，满足定量分析要求。

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  表格1 线性关系考察结果

  Table 1.Investigation results of linear relationship

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2.1.5 精密度试验

分别精密吸取混合对照品溶液各10 μL，按“2.1.1”项下色谱条件连续进样6次，记录各待测成分色谱峰面积。结果显示胞苷、鸟苷、尿苷、腺苷、(R,S)-告依春、靛蓝和靛玉红峰面积的RSD分别为0.68%、0.45%、0.71%、0.34%、0.48%、0.71%和0.84%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.1.6 重复性试验

取药材粉末，分别按“2.1.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，并按“2.1.1”项下色谱条件进行测定，记录各待测成分色谱峰面积。结果显示，胞苷、鸟苷、尿苷、腺苷、(R,S)-告依春、靛蓝和靛玉红的平均含量为0.197 3、0.469 6、0.433 5、0.452 9、1.662 0、0.008 2、0.003 10 mg/g，RSD分别为1.97%、2.05%、2.21%、1.45%、2.42%、1.22%和2.00%（n=6），表明该方法重复性良好。

2.1.7 稳定性试验

取同一板蓝根供试品溶液，在4℃放置保存，按“2.1.1”项下色谱条件，分别于0、4、8、12、20、24 h进样检测并记录峰面积。计算结果显示，胞苷、鸟苷、尿苷、腺苷、(R,S)-告依春、靛蓝和靛玉红峰面积的RSD分别为1.34%、2.25%、1.21%、2.45%、2.52%、1.62%和2.10%（n=6），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.1.8 加样回收率试验

取同一批已经测定的板蓝根样品粉末各0.5 g，精密称定，置于250 mL的具塞锥形瓶中，分别定量加入核苷类和 靛蓝靛玉红混合对照品，加入甲醇溶液25 mL，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样。计算得到各组分的平均加样回收率分别为98.25%、97.75%、98.82%、99.25%、101.25%、101.74%和97.95%，RSD分别为2.34%、1.95%、1.67%、2.87%、2.02%、0.92%和2.20%（n=6），表明方法的准确性良好。

2.2 单因素试验

2.2.1 新鲜药材含水量筛选

采用烘干法（105℃恒重法）测定新鲜板蓝根样品的绝对含水量。在固定热风干燥温度（60℃）和切片厚度（5 mm）的条件下，设置30%、35%、40%、45%、50% 5个含水量梯度。每个梯度平行制备3份供试品溶液，采用HPLC法初步考察不同含水量对药材活性成分保留率的影响。图2结果表明，当含水量从30%增加至40%时，各目标成分的含量总体呈现上升趋势，并在40%含水量时达到峰值；然而，当含水量超过40%后，各成分含量均出现下降趋势。基于这一规律，本研究选择40%含水量作为中心点，进行后续响应面法优化试验。

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  图2 药材含水量对指标性成分影响的折线图（n=3）

  Figure 2.Line graph of the influence of water content of medicinal herbs on index components (n=3)

  注：X1为胞苷；X2为尿苷；X3为腺苷；X4为鸟苷；X5为(R,S)-告依春；X6为靛蓝；X7为靛玉红。

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2.2.2 切片厚度筛选

选取新鲜板蓝根样品（含水量40%），在固定干燥温度（60℃）条件下，分别制备1、2、3、4、5 mm 5种不同厚度的切片。每个厚度梯度制备3个平行样品，采用HPLC法初步考察不同切片厚度对药材活性成分保留率的影响[5]。图3结果表明，切制规格对有效成分提取影响有一定影响，总体在3 mm时到达最佳，而后逐渐下降。故选定切制规格为3 mm作为最佳饮片。

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  图3 切片厚度对指标性成分影响的折线图（n=3）

  Figure 3.Line graph of the influence of slice thickness on index components (n=3)

  注：X1为胞苷；X2为尿苷；X3为腺苷；X4为鸟苷；X5为(R,S)-告依春；X6为靛蓝；X7为靛玉红。

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2.2.3 干燥温度筛选

采用恒温鼓风干燥箱对新鲜板蓝根样品（含水量45%，切片厚度3 mm）进行干燥处理，设置50、55、60、65、70℃ 5个温度梯度。每个温度点制备3个平行样品，采用HPLC法初步考察不同干燥温度对药材活性成分保留率的影响[6]。图4结果表明，干燥温度对有效成分提取影响效果显著，在干燥温度60℃时总体成分到达最佳，而后逐渐下降。故选定干燥温度为60℃。

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  图4 干燥温度对指标性成分影响的折线图（n=3）

  Figure 4.Line graph of the influence of drying temperature on index components (n=3)

  注：X1为胞苷；X2为尿苷；X3为腺苷；X4为鸟苷；X5为(R,S)-告依春；X6为靛蓝；X7为靛玉红。

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2.3 Box-Behnken 试验

2.3.1 试验设计

在单因素试验的基础上，选取含水量（A）、切制规格（B）、干燥温度（C）3个关键工艺参数作为考察因素，采用Design Expert 8.0软件设计了三因素三水平的响应面试验方案[7-8]。以板蓝根中胞苷（X₁）、尿苷（X₂）、腺苷（X₃）、鸟苷（X₄）、(R,S)-告依春（X₅）、靛蓝（X₆₇）和靛玉红（X₇）7种活性成分的综合评分为评价指标，通过加权评分法对板蓝根产地加工炮制一体化工艺进行系统优化。

鉴于各成分的药效贡献权重尚不明确，本研究采用等权重原则，设定各成分权重系数均为1/7。具体评分方法为：以各成分含量最大值为100分基准，其余样品中各成分含量按与最大值的比例折算得分，综合评分（Y）计算公式为：Y=（X₁/max1+X₂/max2+X₃/max3+X₄/max4+X₅/max5+X₆₇/max6 +X₇/max7）×100/7[4-5]。试验因素水平设计见表2，完整的试验方案与结果数据见表3。

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  表格2 Box-Behnken的试验设计因素与水平表

  Table 2.Box-Behnken test design factors and levels table

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  表格3 Box-Behnken试验设计方案与结果

  Table 3.Design and results of Box-Behnken test

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2.3.2 模型的建立与分析

采用Design Expert 8.0软件对各组试验数据进行多元回归分析和二项式拟合，建立了三因素二次回归模型：Y=89.17-1.07A-3.75B-0.88C-3.83AB-1.98AC+3.86BC-8.23A²-5.58B²-4.92C²。表4的方差分析结果显示，模型F值为34.07（P ＜0.001），表明该回归模型具有高度显著性，能够较好地拟合试验数据，适用于板蓝根产地加工炮制一体化工艺的优化。进一步分析表明，切制规格（B）、含水量与切制规格的交互作用（AB）、切制规格与干燥温度的交互作用（BC）以及各因素的二次项（A²、B²、C²）对综合评分的影响极显著（P＜0.01），而含水量与干燥温度的交互作用（AC）也达到显著水平（P＜0.05），说明各因素对响应值的影响呈现复杂的非线性关系。

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  表格4 回归模型方差分析结果

  Table 4.Analysis of variance results of regression model

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通过Design Expert 8.0软件绘制的响应面图直观地展示了各因素间的交互作用。图5A和图5B显示，含水量与切制规格（AB）、含水量与干燥温度（AC）的交互作用响应面坡度陡峭，表明这两个交互项对综合评分影响较大；而图5C中切制规格与干燥温度（BC）的交互作用响应面相对平缓，说明该交互作用对综合评分的影响较弱，这一结果与方差分析中BC项虽具有极显著性但影响程度相对较小的结论相吻合。这些发现为板蓝根加工工艺的优化提供了重要的理论依据。

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  图5 交互作用响应面图

  Figure 5.Interaction response surface diagram

  注：A. 含水量和切制规格；B. 含水量和干燥温度；C. 干燥温度和切制规格。

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2.3.3 最佳工艺预测及验证

通过Design-Expert 8.0.6软件优化分析，确定板蓝根产地加工的最佳工艺参数为：含水量40.38%、切制规格2.54 mm、干燥温度58.57℃，此时综合评分的理论预测值可达90.117 9分。为便于实际操作，将工艺参数调整为：含水量40%、切制规格2.5 mm、干燥温度58℃。

3 讨论

近年来，中药材产地加工炮制一体化工艺研究日益受到学界重视。已有川芎、黄芪、虎杖、秦皮等药材的一体化工艺研究[9-11]，证实了该模式的可行性，表明一体化工艺将成为中药现代化发展的重要趋势。板蓝根作为甘肃道地药材，开展其产地加工与饮片炮制一体化研究，对从源头保障饮片质量具有重要的实践指导价值[12-13]。

本研究基于响应面法，在单因素试验基础上对板蓝根产地加工炮制工艺进行了系统优化[14]。所建立的二次多项式数学模型具有显著统计学意义，经软件分析确定最佳工艺参数为：含水量40%、切制规格2.5 mm、干燥温度58℃。该工艺可有效解决传统加工方式存在的运输过程有效成分流失问题，通过减少中间贮藏和加工环节，显著降低生产成本和能源消耗，符合中药材绿色经济生产要求[15-16]。与传统加工方法相比，新工艺可节约能耗约15%，人力成本降低20%，具有明显的经济和生态效益。由于板蓝根药材的采挖季节为秋季，当前无法进行验证试验，计划于今年秋季采挖期开展后续验证工作。根据方法学要求，验证试验应进行3次平行试验，且实测综合评分与理论预测值的相对偏差应小于2%，方可认为模型预测值与实际结果具有良好吻合度[17]。届时将根据验证结果进一步评估和优化该工艺参数。

然而，本研究仍存在一定局限：首先，所建模型基于实验室规模数据，尚未进行中试放大验证；其次，工艺控制采用静态参数，缺乏实时动态监测与智能调控系统；再者，环境效益评估主要关注加工环节缩减，未建立全生命周期碳排放等量化指标体系。未来研究应重点开展以下工作：①进行中试规模验证，评估工艺稳定性；② 结合物联网技术开发智能监控系统；③拓展至其他根茎类药材的工艺优化；④建立标准化绿色加工评价体系。

综上所述，本研究优化的板蓝根一体化炮制工艺具有操作简便、稳定性好的特点，为其工业化生产提供了科学依据。后续研究将进一步完善工艺参数，推动中药加工技术向智能化、绿色化方向发展。

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